احتياطات لاستخدام أنبوب الترشيح الفائق

(1) حدد أنبوب الترشيح الفائق المناسب. بشكل عام ، يجب ألا يزيد الوزن الجزيئي المراد الاحتفاظ به عن 1 / 3 من الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف. على سبيل المثال ، إذا كان الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف هو 35kDa ، يمكن اختيار أنبوب الترشيح الفائق بوزن جزيئي 10kDa. إذا كان الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف حوالي 10 كيلو د. ، يمكن استخدام أنبوب الترشيح الفائق بوزن جزيئي يبلغ 3 كيلو د.ك. اقرأ بعناية دليل التعليمات وانتبه إلى التسامح المختلف لغشاء الترشيح الفائق للمواد الكيميائية المختلفة.

(2) الترشيح الفائق الذي تم شراؤه حديثا جاف. أضف ماء فائق النقاء قبل الاستخدام ، وسوف يمر الماء بالكامل عبر الغشاء. قم بتبريده مسبقا في حمام ثلجي أو ثلاجة لبضع دقائق. ثم صب الماء وإضافة محلول البروتين. يجب ألا يتجاوز المبلغ المضاف الخط الأبيض الموجود أعلى الأنبوب. يجب أن تكون العملية خفيفة. قبل إضافة محلول البروتين ، يجب إدخال أنبوب الترشيح الفائق على الثلج للتبريد المسبق.

(3) التوازن. يجب أن تكون كل من الكتلة ومركز الثقل متوازنة. لاحظ أن السرعة والتسارع لا ينبغي أن يكونا سريعين جدا ، وإلا فإن غشاء الترشيح الفائق سوف يتلف مباشرة. بدء الترشيح الفائق بالطرد المركزي (التبريد المسبق لأجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات). بعد تحويل RPM لأجهزة الطرد المركزي المختلفة إلى G ، يكون الأمر مختلفا. اضبط تسارع جهاز الطرد المركزي على أدنى ترس لتقليل الضغط على الغشاء. لاحظ أنه يجب عليك الانتظار حتى يصل جهاز الطرد المركزي إلى السرعة المستهدفة قبل مغادرة جهاز الطرد المركزي ، وإلا عندما تكون هناك مشكلة في جهاز الطرد المركزي ، لا يمكنك التعامل معها في المرة الأولى. يجب ضبط اتجاه الغشاء والعمود الدوار وفقا للتعليمات (في حالة جهاز الطرد المركزي الدوار الزاوية ، يكون الغشاء عموديا على العمود). في الاستخدام العملي ، تكون السرعة أقل عموما من تلك الموجودة في الدليل ، والتي يمكن أن تطيل عمر خدمة أنبوب الطرد المركزي.

(4) عندما يتم تركيزه على 1 مل المتبقية ، خذ محلول المخزن المؤقت 50ul وأضف 10ul للتدفق لمعرفة ما إذا كان يتحول إلى اللون الأزرق ، وذلك للحكم على ما إذا كان أنبوب الترشيح الفائق يتسرب البروتين. إذا تسرب الأنبوب ، صب الطبقة العليا وتدفق عبر الأنبوب الجديد وابدأ الترشيح الفائق. للحكم بدقة على ما إذا كان الأنبوب يتسرب ، قم بجهاز طرد مركزي مع 5mgml BSA لمدة 10 دقائق ، ثم خذ التدفق من خلاله ، وقم بتشغيل غراء البروتين أو برادفورد للقياس الخام ، واستمر في إضافة محلول البروتين المتبقي للتركيز (يعمل على الجليد لمنع تسخين البروتين) حتى تتم إضافة جميع المحاليل المركزة. انتبه إلى ما إذا كان هطول الأمطار البروتينية يحدث أثناء الطرد المركزي ، مما يؤدي إلى انسداد الأنابيب. في حالة حدوث هطول الأمطار ، حدد السبب المحدد لهطول الأمطار ، سواء كان تركيز البروتين مرتفعا جدا أو أن المخزن المؤقت غير مناسب ؛ يمكن حل الأول عن طريق الترشيح الفائق المتزامن مع أنابيب الترشيح الفائق المتعددة لتقليل التركيز. هذا الأخير هو تغيير المحاليل العازلة المختلفة حتى لا يترسب البروتين.

(5) تستخدم الخطوات السابقة لتركيز البروتين. إذا كنت ترغب في تغيير المخزن المؤقت ، عندما يتركز محلول البروتين الكلي إلى حوالي 1 مل ، أضف بلطف عازلا جديدا (الترشيح الفائق من خلال غشاء الترشيح الفائق 0.22um) ، ثم ركز إلى حوالي 1 مل لثلاث مرات متتالية. يعتمد الحجم النهائي للتركيز الأخير على تركيز البروتين المطلوب ، والذي لا يزيد عموما عن 500 لتر ، أو يمكن تركيزه إلى أقل من 200 مل. وفقا لتركيز الحجم الذي لا يقل عن 10 مرات في كل مرة ، يمكن أن يصل إلى أكثر من 1000 مرة ثلاث مرات ، والتي يمكن أن تحقق بشكل أساسي الغرض من تغيير المخزن المؤقت.