دليل لتنقية البروتين المؤتلف عالي الجودة: تحسين عملية المصب وتطبيقات ترشيح التدفق العرضي

تستخدم البروتينات المؤتلف على نطاق واسع في المستحضرات الصيدلانية الحيوية ، وتطوير اللقاح ، وفي التشخيصات المختبرية . تؤثر جودة تنقيةها بشكل مباشر على النشاط والاستقرار وسلامة المنتج النهائي . تنقية المئوية (TFF). أصبح على نحو متزايد أداة حيوية في سير عمل تنقية البروتين .

تحدد هذه المقالة بشكل منهجي الخطوات الرئيسية في تنقية المصب للبروتينات المؤتلف ، مع التركيز على استراتيجيات تطبيق تقنية TFF . تهدف إلى مساعدة المستخدمين والمستخدمين الصناعيين في تحسين عمليات التطهير وتعزيز جودة البروتين .

 

I . الخطوات الأساسية في تنقية المصب للبروتينات المؤتلف

1. حصاد وتحلل الخلية

الطرد المركزي/ترشيح العمق: يزيل حطام الخلايا والشوائب ؛ مناسبة للبكتيريا ، الخميرة ، إلخ . ، أنظمة التعبير .

Sonication/تجانس الضغط العالي: يكسر الخلايا لإطلاق البروتينات المستهدفة ؛ تتطلب الشروط التحسين لمنع تغيير البروتين .

التحلل الأنزيمي: E . g . ، علاج lysozyme للبكتيريا ؛ الظروف اللطيفة ولكن تكلفة أعلى .

2. التنقية الأولية: التقاط البروتين المستهدف

كروماتوجرافيا التقارب (e . g . ، His-tag ، protein a/g): inting stystrality ؛ يحقق نقاء عالي في خطوة واحدة .

كروماتوجرافيا التبادل الأيوني (IEX): يفصل البروتينات بناءً على اختلافات الشحن ؛ مناسبة لتنقية المرحلة من وقت مبكر إلى الوسط .

كروماتوجرافيا التفاعل مسعور (HIC): يستخدم الاختلافات في مسعور سطح البروتين ؛ فعالة لبعض البروتينات التي يصعب تهيجها .

3. التلميع: تعزيز النقاء

تحليل كروماتوجرافيا الحجم (SEC): يزيل المجاميع وشوائب الجزيئات الصغيرة ؛ سعة التحميل المحدودة .

كروماتوجرافيا متعددة الوسائط (e . g . ، capto jost): يجمع بين أوضاع التفاعل المتعددة لدقة أعلى .

4. التركيز وتبادل المخزن المؤقت

أجهزة الطرد المركزي الفائق الترشيح: مناسبة للعينات الصغيرة ؛ عرضة لفقدان البروتين .

ترشيح التدفق العرضي (TFF): فعال ، قابل للتطوير ، مثالي للإنتاج الصناعي (مفصل لاحقًا) .

5. التعقيم والتخزين

0 . 22 ميكرون الترشيح: يزيل الكائنات الحية الدقيقة التي تضمن العقم.

إضافة مثبتات (e . g . ، glycerol ، bsa): يمنع تدهور البروتين .

 

II . تطبيقات مفتاح ترشيح التدفق العرضي (TFF) في تنقية المصب

تقليل ترشيح التدفق العرضي (TFF) يقلل من تلوث الغشاء عن طريق التدفق العرضي ، مما يجعله مناسبًا للتركيز ، والحماس ، وتبادل العينات ذات الحجم الكبير . يوفر مزايا كبيرة على الترشيح المميت) {. g

 

1. مزايا تقنية TFF

✔ الانتعاش العالي: يقلل من خسائر امتصاص البروتين ، وخاصة الحاسمة للعينات الثمينة .

✔ قابلية التوسع الخطية: قابلة للتطبيق من مقياس المختبر (10 مل) إلى مقياس الإنتاج (1000L+) .

✔ مرونة العملية: يمكن لنظام واحد أن يؤدي التركيز ، غسيل الكلى (تبادل المخزن المؤقت) ، وترشيح diafiltration .

 

2. دليل اختيار الغشاء/الغشاء TFF

مادة الغشاء	صفات	سيناريوهات التطبيق
polyethersulfone (PES)	ربط البروتين المنخفض ، مستقر كيميائيًا (مقاوم للـ PH) ، تدفق مرتفع	شروط العازلة القاسية
الجدد السليلوز (RC)	ربط البروتين المنخفض ، وتدفق مرتفع ، بروتين روتيني	تنقية البروتين/الأجسام المضادة الروتينية

إرشادات اختيار قطع الوزن الجزيئي (MWCO):

1/3 إلى 1/5 من الوزن الجزيئي للبروتين الهدف (E . g . ، استخدم غشاء 10 كيلو دالتون لبروتين 30 كيلو دالتون) .

لإزالة المجاميع ، اختر حجم مسام أصغر (E . g . ، استخدم غشاء 50 كيلو دالتون لبروتين 100 كيلو دالتون) .

 

3. تحسين معلمات تشغيل TFF الحرجة

ضغط الغشاء (TMP): عادة 3-15 رطل. ارتفاع TMP العالي بشكل مفرط يعزز قاذورات .

معدل التدفق العرضي: يحافظ على الاضطراب لتقليل استقطاب التركيز ؛ عادة 4-8 لتر/دقيقة · م² .

تقنيات تحسين العائد:

استخدم أحجام مخزن المؤقت 2-5 أثناء الترشيح للتبادل الكامل .

قم بتنفيذ التدفق الخلفي في النهاية لاستعادة البروتين المتبقي .

 

4. دراسة حالة نموذجية: تنقية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MAB)

سائل ثقافة الخلية الموضحة → البروتين A التقارب كروماتوجرافيا → تعطيل الفيروسي المنخفض PH → تركيز TFF + تبادل المخزن المؤقت → التلميع (SEC/IEX) → ترشيح معقم

 

دور TFF:

يركز بسرعة البروتين المخفف A إلى التركيز المستهدف .

تبادل المخزن المؤقت إلى PBS أو Buffer (E . g . ، Histidine Buffer) .

 

III . المشاكل والحلول الشائعة

❌ المشكلة 1: انخفاض انتعاش البروتين

الأسباب المحتملة: امتصاص الغشاء ؛ هطول الأمطار بسبب التركيز الزائد .

الحلول: التبديل إلى الغشاء المنخفض الملزم ؛ أضف SurfActant (e . g . ، 0 . 01 ٪ Tween 20).

❌ المشكلة 2: انخفاض التدفق السريع

الأسباب المحتملة: قاذفة الغشاء أو استقطاب التركيز .

الحلول: تحسين معدل التدفق العرضي ؛ تنفيذ التنظيف الخلفي المنتظم. قم بالتبديل إلى بنية غشاء أكثر انفتاحًا (E . g . ، 30 kDa بدلاً من 10 كيلو دالتون) .

❌ المشكلة 3: تجميع البروتين

الأسباب المحتملة: قوة القص المفرطة ؛ المخزن المؤقت غير المناسب .

الحلول: تقليل سرعة المضخة ؛ استخدم مخازن الأفران اللطيفة (e . g . ، تحتوي

 

IV . ملخص

يعتمد الحصول على بروتينات مؤتلف عالية الجودة على تحسين عمليات تنقية المصب . تقنية ترشيح التدفق العرضي (TFF) ، مع كفاءتها وقابلية التوسع ، أصبحت أداة مهمة لتركيز وتبادل التبادل المبروسغرافيا ، وترويج الصلاحية ، وتكنولوجيا الفنيين. تعزيز ، تلبية متطلبات كل من الأبحاث والإنتاج على نطاق صناعي .