تكنولوجيا الأغشية وتوضيح اللقاحات (1)

تأتي اللقاحات من مجموعة متنوعة من المصادر، بما في ذلك مستخلصات الأنسجة، والخلايا البكتيرية، والجسيمات الفيروسية، والبروتينات والأحماض النووية التي تنتجها الخلايا الثديية المعاد تركيبها، وخلايا الخميرة والحشرات.

تعتمد الطريقة الأكثر شيوعًا لإنتاج اللقاح على عملية تخمير أولية تليها عملية تنقية. إن إنتاج اللقاح عملية معقدة تتضمن العديد من الخطوات والعمليات المختلفة. يعد اختيار طريقة التنقية الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية لتحقيق نقاء المنتج النهائي المطلوب. يعد توضيح اللقاحات خطوة مهمة لها تأثير كبير على استعادة المنتج والتنقية اللاحقة. يمكن استخدام العديد من التقنيات لتوضيح اللقاحات. يعتمد اختيار طريقة التجميع والمعدات على نوع البطارية وطبيعة المنتج الذي يتم جمعه وسائل العملية. تشمل هذه التقنيات الترشيح الغشائي (الترشيح الدقيق والترشيح بالتدفق المماسي) والطرد المركزي والترشيح العميق (الترشيح بالتدفق الطبيعي). من خلال الخبرة الطويلة، يتم عادةً تحقيق توضيح حصاد اللقاح عن طريق الطرد المركزي متبوعًا بالترشيح العميق.

 

في السنوات الأخيرة، اكتسبت التقنيات القائمة على الأغشية أهمية كبيرة في تنقية اللقاحات. تستخدم العمليات الأولية بشكل متزايد تقنيات يمكن التخلص منها، لذا يجب تغيير استراتيجيات الحصاد. تقدم هذه المقالة نظرة عامة شاملة على التقنيات المختلفة القائمة على الأغشية وتطبيقاتها في تنقية اللقاحات.

 

01 المقدمة

تشكل اللقاحات عنصرا أساسيا في الوقاية من الأمراض المعدية، التي تظل سببا صادما للوفاة. وبفضل التحصين، يتم إنقاذ ما بين 2 و3 ملايين شخص من الخناق والتيتانوس والسعال الديكي والحصبة كل عام. وتغطي اللقاحات مجموعة واسعة، من البروتينات الصغيرة المعاد تركيبها إلى جزيئات الفيروس الكاملة والبكتيريا الكاملة. ويمكن إنتاجها بواسطة أنظمة مختلفة: البيض والخلايا الثديية والبكتيريا، إلخ. ونظرا لتعقيد اللقاحات وتنوعها، لا يوجد حاليا بروتوكول أو قالب تنقية رئيسي، على الرغم من الاهتمام المتزايد بمنصات اللقاحات.

 

عادةً، يمكن تقسيم عملية اللقاح إلى ثلاثة أجزاء: المنبع (الإنتاج والتوضيح)، والمعالجة اللاحقة (التنقية بما في ذلك الترشيح الفائق والكروماتوغرافيا والمعالجة الكيميائية)، والصياغة (عمليات التعبئة النهائية). وبصرف النظر عن نظام الإنتاج، تلعب عملية التوضيح (الإزالة الأولية للمواد غير المرغوب فيها) دورًا رئيسيًا في تحديد عملية تنقية قوية. تزيل خطوة التوضيح المناسبة بشكل أساسي الخلايا الكاملة وحطام الخلايا والغرويات والتجمعات الكبيرة لتقليل عبء المعالجة اللاحقة. في بعض الحالات، يمكن أن تقلل عملية التوضيح أيضًا من الشوائب غير القابلة للذوبان وبروتينات الخلايا المضيفة (HCP) والأحماض النووية للخلايا المضيفة. مثل أي خطوة تنقية أخرى، يجب تحسين خطوة التوضيح لتحقيق أقصى قدر من إنتاجية المنتج ونقاوته مع التكيف مع قيود خصوصية وإنتاج اللقاح.

 

ونظرًا لتباين أنواع اللقاحات، يتم استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات للتوضيح، بما في ذلك الطرد المركزي أو الترشيح (الجدول 1).

 

عادة ما تكون هناك حاجة إلى عدة سلاسل من العمليات لتحقيق الوضوح المطلوب. تم تصميم العملية الأولى لإزالة الجسيمات الأكبر (التوضيح الأولي) وتم تصميم العملية الثانية لإزالة الغرويات والجسيمات الأخرى التي يقل حجمها عن الميكرون (التوضيح الثانوي). تعمل الطرد المركزي منخفض السرعة كخيار توضيح لمرة واحدة، مما يسمح بإزالة الخلايا وحطام الخلايا عن طريق الترسيب. يمكن للطرد المركزي التعامل مع الأحمال الصلبة العالية وقد تم استخدامه على نطاق واسع في الوضع الدفعي أو المستمر وأجهزة الطرد المركزي القرصية. يتطلب استثمارًا رأسماليًا مرتفعًا وتكاليف صيانة، ويواجه تحديات في التوسع بسبب عدم وجود نموذج تقليص موثوق به. ومع ذلك، يستخدم بعض مصنعي اللقاحات التجارية أجهزة الطرد المركزي في الإنتاج واسع النطاق الذي ينطوي على أحجام معالجة عالية وأنشطة إنتاجية أكثر.

 

يمكن إجراء الترشيح التوضيحي عن طريق الترشيح بالتدفق الطبيعي (NFF، المعروف أيضًا باسم الترشيح المسدود) أو الترشيح بالتدفق المماسي (TFF، المعروف أيضًا باسم الترشيح بالتدفق المتقاطع). هناك أيضًا أوضاع ترشيح محددة (مرشحات عميقة) تحتوي على مواد مشحونة إيجابيا ومساعدات ترشيح تعمل على تعزيز الاحتفاظ بحطام الخلايا والغرويات والمكونات غير المرغوب فيها المشحونة سلبًا.

 

تحتفظ مرشحات الغشاء بالجسيمات من خلال استبعاد الحجم ولا تتمتع بسعة عالية للاحتفاظ بالأوساخ، لذا فهي مناسبة لخطوات التوضيح الثانوي. كل من المرشحات العميقة ومرشحات الغشاء سهلة التوسع والتنفيذ (تصميم نظام بسيط). على عكس NFF، يتم استخدام TFF بشكل أساسي للتوضيح الأولي (الترشيح الدقيق). تم استخدام الأغشية ذات النطاق القطعي 0.1-0.65 ميكرومتر (يفضل أن تكون ذات قناة مفتوحة) بنجاح للاحتفاظ بالخلايا وحطام الخلايا والمواد الملوثة الكبيرة الأخرى. معظم معدات TFF قابلة للتوسع خطيًا وقابلة لإعادة الاستخدام بعد التنظيف، مما يقلل بشكل كبير من تكلفة المواد الاستهلاكية للخطوة.

 

تقع خطوة التوضيح بين العمليات الأولية والنهائية ويتم تجاهلها أحيانًا أثناء تطوير عملية اللقاح لأن الوقت والموارد يتم منحها الأولوية لخطوات التنقية الأخرى، مثل الكروماتوغرافيا أو الطرد المركزي لتدرج الكثافة.

 

وحتى براءات الاختراع الخاصة بعمليات تصنيع اللقاحات غالبًا ما تغفل خطوة التوضيح. وتؤثر كفاءة التوضيح بشكل مباشر على أداء العملية اللاحقة. ويمكن أن تؤثر خطوة التوضيح غير المحسنة بشكل جيد سلبًا على سعة الفلتر المعقم أو قد تقصر من عمر خدمة الراتينج الكروماتوغرافي. واليوم، تميل التوقعات التنظيمية الأكثر صرامة إلى جعل مصنعي اللقاحات ينتجون لقاحات أنقى وأكثر تميزًا ولكن بأسعار معقولة. وفي هذه الحالة، يجب إعطاء كل خطوة الاهتمام الذي تستحقه. تشير الاتجاهات الحالية إلى أن العملية السابقة تتجه نحو نظام تعبير "أنظف" (أي أن الخلايا المزروعة في وسائط خالية من المصل تحل محل البيض) مع زيادة الإنتاجية وكثافة الخلايا الأعلى.

 

إن عمليات التنقية اللاحقة يتم تبسيطها وتبسيطها لزيادة نقاء المنتج النهائي. وللتعامل مع هذه التغييرات، لا يمكن لخطوة التوضيح أن تصبح عقبة. وفي هذه الحالة، تواجه تقنية الترشيح تحديًا جديدًا للتوضيح، حيث تعالج قضايا زيادة مرونة العملية، وإمكانية الاستخدام الفردي، وخفض تكاليف الاستثمار.

 

02 توضيح بشأن لقاحات الفيروسات

لقد تم استخدام عدة أنواع من طرق التوضيح، إما بمفردها أو مجتمعة، بنجاح لتوضيح الحصاد في نهاية تغذية اللقاحات.

مقياس تجريبي: 1-20 لتر، مقياس الإنتاج: أكثر من 20 لتر

 

2.1 الاحتياطات اللازمة لتوضيح لقاح الفيروس

تحتوي العديد من اللقاحات على كل أو جزء من جزيئات الفيروس لتكوين مناعة ضد العدوى الفيروسية. وهي تنقسم عمومًا إلى أربع فئات عريضة:

اللقاح الحي المضعف (LAV)، والذي يعتمد على سلالة ضعيفة من الفيروس لتقليل ضراوته. يمكن للفيروسات المضعفة أن تتكاثر في الجسم ولكنها ليست مسببة للأمراض.

- لقاحات الفيروسات المعطلة (IV)، والتي تحتوي على فيروسات معطلة كيميائيًا أو بالأشعة فوق البنفسجية للقضاء على العدوى. يمكن أن تكون جزيئات الفيروس كاملة أو مقسمة أو منقاة (بروتينات مستضدية فقط).

- لقاح الناقل الفيروسي (VV) هو فيروس نشط غير مسبب للأمراض يقدم مستضد فيروس مسبب للأمراض. تُستخدم هذه الهياكل التي تم تطويرها مؤخرًا أيضًا في تطبيقات العلاج الجيني.

لقاحات الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs)، وهي فئة محددة من لقاحات الوحدات الفرعية الفيروسية التي تحاكي البنية العامة للجسيمات الفيروسية ولكنها لا تحتوي على مادة وراثية معدية.

 

في معظم الحالات، تكون الجزيئات الفيروسية سليمة تمامًا أثناء خطوة التوضيح، حتى أثناء تحلل اللقاح الفيروسي (عادةً ما يتم إجراء الانقسام في اتجاه مجرى النهر، في بيئة أكثر نقاءً).

التحدي الرئيسي لتوضيح الفيروسات هو استعادة الجسيمات الفيروسية عالية الغلة مع إزالة حطام الخلايا والتكتلات الكبيرة والمواد الملوثة غير القابلة للذوبان بكفاءة. وكما هو موضح في الأقسام التالية، هناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسبب تدهور الفيروس أو فقده. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الصعب الاعتماد على الغلة الفيروسية بسبب التباين العالي لطرق التحليل الكمي للفيروس في هذه المرحلة من العملية، وخاصة بالنسبة للقاحات LAV وVV. بالنسبة لهذه اللقاحات، غالبًا ما يتم تقييم الغلة الفيروسية باستخدام اختبارات العدوى مثل اختبار اللويحة أو اختبار TCID 50. إن حقيقة أن بعض المركبات المحصودة قد تتداخل مع قدرة الفيروس على إصابة الخلايا الدالة تزيد من تباين هذا النهج الكمي.

 

2.2 استراتيجية توضيح لقاح الفيروس

تختلف اللقاحات الفيروسية بشكل كبير من حيث الحجم والبنية والشكل وأنظمة التعبير (الجدول 3).

ونتيجة لذلك، لا يوجد عمومًا نموذج للعمليات اللاحقة، وخاصة خطوات التوضيح. من الناحية النظرية، يمكن اختيار جميع التقنيات المتاحة (الطرد المركزي منخفض السرعة، والترشيح الدقيق TFF، وNFF) ودمجها بشكل محتمل لتوضيح الفيروس. في الواقع، يتأثر نجاح طرق التوضيح بنظام التعبير والخصائص الفيزيائية والكيميائية للفيروسات المعنية.

 

Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>أظهرت طريقة تنقية ({{0}} خلية/مل) باستخدام البوليمرات الكاتيونية، أن مساحة الترشيح العميق قد انخفضت بمقدار 4 مرات مقارنة بالطرق التقليدية. تسمح هذه التقنية بحصاد المخمرات ذات السعة الكبيرة دون استخدام أجهزة الطرد المركزي. وبالمثل، أظهر Riske et al. أن معالجة الكيتوزان لـ 40 لترًا من مزارع الخلايا (0.02٪) التي تحتوي على 1.4-2.6٪ من المواد الصلبة أدت إلى زيادة بمقدار 7- ضعفًا في سعة الترشيح المطلقة بعد الترشيح العميق.

 

كما ذكروا أن الكيتوزان يبدو أنه يحسن كفاءة التوضيح عن طريق تكتل الجسيمات دون الميكرون، والتي تستقر عادة في أجهزة الطرد المركزي. ومن المرجح أن تستمر طرق المعالجة المسبقة والتكتل في أن تكون جزءًا من توضيحات ترشيح اللقاحات في المستقبل. تعمل المواد المخترقة، بما في ذلك السكريات والجليكول والأحماض الأمينية، على تكتل الفيروسات بشكل تفضيلي. يمكن استخدام تكتل الفيروس بمحلول تناضحي متبوعًا بترشيح دقيق بنسبة 0.2µ كعملية شاملة لتنقية الفيروسات. يمكن للمواد المخترقة تحفيز التجمع الفيروسي عن طريق تقليل طبقة الترطيب حول الجسيمات لتكتل جزيئات الفيروس غير المغلفة الكارهة للماء وجزيئات الفيروس المغلفة. على الرغم من إثبات تكتل الجزيئات المخترقة للفيروسات، إلا أن الطريقة لديها القدرة على أن تكون منصة لتنقية اللقاحات في المستقبل، ولم يتم إثبات جدواها في تنقية اللقاحات التجريبية أو واسعة النطاق. تتم عملية المعالجة المسبقة بالتخثر، والتي من المرجح أن تستمر في أن تكون جزءًا من تنقية مرشح اللقاح في المستقبل، في وعاء تخمير سعة 2 لتر. من أجل استخدامها في عمليات الإنتاج واسعة النطاق، يجب التحقق من صحة هذه الطرق على نطاق تجريبي وإنتاجي.

 

2.2.1 التعبير عن تأثير النظام

تعتمد طريقة التوضيح بشكل أساسي على نوع العملية السابقة ونظام التعبير، والذي يحدد نوع ومستوى الملوثات المراد إزالتها. عادة ما يتم إنتاج اللقاحات الفيروسية في أجنة الدجاج من خلال خطوط الخلايا المستمرة للثدييات أو الطيور أو خلايا الفيروسات العصوية/الحشرات، والتي تعد نظام تعبير أكثر تعقيدًا. يمكن أيضًا إنتاج بعض أنواع VLPs بواسطة أنظمة تعبير غير متجانسة أخرى (البكتيريا والخميرة والخلايا النباتية).

 

2.2.1.1 الفيروس الناتج في جنين الدجاج

لقد تم إنتاج اللقاحات في البيض لعقود من الزمن. يعود تاريخ هذا العمل إلى عام 1931، عندما نجح وودروف وجود باستور في استخدام الغشاء المشيمي للبيض المخصب كركيزة لنمو الفيروسات. واليوم، لا يزال يتم إنتاج العديد من اللقاحات البشرية والبيطرية باستخدام هذه العملية القديمة. وربما يكون اللقاح الأكثر شهرة هو لقاح الإنفلونزا الموسمية. والمبدأ هو تطعيم بيض الدجاج بالفيروسات ذات الاهتمام ثم التكاثر في الغشاء المشيمي. وبعد التكاثر، يتم جمع السائل الغني بالجسيمات الفيروسية وتنقيته.

 

السائل اللانتوي هو علف توضيحي صعب. محتواه العالي من المعادن والبروتين (بما في ذلك ألبومين البيض) يمنحه لزوجة عالية. يحتوي السائل اللانتوي أيضًا على مركبات أنسجة أساسية من أجنة الدجاج، مثل الريش أو المنقار أو الأوعية الدموية أو خلايا الدم. نظرًا لمحتوى المواد الصلبة العالي، فإن الطرد المركزي منخفض السرعة هو الخيار المفضل للتوضيح الأولي، مما يؤدي عادةً إلى معدل استرداد يبلغ حوالي 70٪. ومع ذلك، فإن التوضيح الأولي باستخدام تقنيات الترشيح ممكن أيضًا. بالنسبة لـ NFF، تتمتع المرشحات العميقة القائمة على البولي بروبيلين والسليلوز بقدرات جيدة على جمع السوائل اللانتوية. يمكن أن يكون للمرشحات السطحية المصنوعة من البولي بروبيلين أو المرشحات العميقة القائمة على السليلوز سعة 150-210 لتر / م 2 وتقليل عكارة تدفق العلف بما يصل إلى 3 مرات. جهاز TFF لقناة التغذية المفتوحة مناسب أيضًا لتوضيح السوائل اللانتوية، حيث أن الجهاز أكثر ملاءمة للحد الأدنى من فقدان الضغط من خلال قناة التغذية، وبالتالي تقليل انسداد القناة.

 

يمكن إجراء خطوة التوضيح الثانوي بسهولة باستخدام NFF. يظهر مزيج من مواد البولي بروبيلين والسليلوز والألياف الزجاجية كفاءة جيدة بشكل عام، والبديل لخطوة التوضيح الثانوي هو استخدام TFF وجهاز غشاء الترشيح الدقيق {{0}}.65μm أو 0.45μm وتشغيل التحكم في التدفق التناضحي. يمكن استخدام جهاز TFF ذي القناة المفتوحة مع PVDF المحب للماء أو غشاء PES المحب للماء في هذه الخطوة.

من المهم ملاحظة أن الجسيمات الفيروسية قد ترتبط بمواد حطام غير قابلة للذوبان، مما قد يقلل بشكل كبير من إنتاج الفيروسات أثناء التوضيح. يمكن أن يؤدي استخدام محلول ملحي إلى تقليل هذا الارتباط بين فيروسات الإنفلونزا والأجزاء الصلبة، مما يؤدي إلى زيادة الإنتاج بمقدار الضعف تقريبًا دون التأثير على سلامة الجسيمات الفيروسية.

 

2.2.1.2 الفيروسات المنتجة في خطوط الخلايا الثديية والطيور المتعاقبة

في الآونة الأخيرة، ابتعدت بعض اللقاحات الفيروسية عن العمليات القائمة على البيض لصالح العمليات القائمة على زراعة الخلايا (خاصة بالنسبة للقاحات الأنفلونزا). والسبب الرئيسي وراء هذا التحول هو منع مشاكل إنتاج اللقاح المرتبطة بالبيض الجنيني (أي نقص إمدادات البيض التي قد تحدث في حالة تفشي أي مرض في الدواجن). ونتيجة لهذا، يتم حاليًا تطوير العديد من أنواع اللقاحات والناقلات الفيروسية باستخدام سلالات الخلايا المستمرة من الثدييات أو الطيور، أو سلالات الخلايا التقليدية (مثل سلالات خلايا Vero أو MDCK أو HEK293)، أو سلالات الخلايا الملكية.

 

اعتمادًا على نظام التعبير، قد يبقى الفيروس داخل الخلية، مما يتطلب خطوة انحلال الخلية، أو قد يبقى خارج الخلية (الانحلال أو التبرعم). الحمل الصلب والمحتوى القابل للذوبان الناتج عن زراعة الخلايا أنظف بكثير من الطور السائل الألانتوي. ونتيجة لذلك، فإن تقنية NFF أسهل في التنفيذ والسعة أعلى بكثير. ومع ذلك، تعتمد سعة الترشيح بشكل كبير على ظروف زراعة الخلايا، مثل كثافة الخلايا أو قابلية الخلايا للبقاء عند الحصاد. تؤثر هذه المعلمات على كمية حطام الخلايا والتجمعات الكبيرة التي يمكن أن تسد المرشحات والأغشية العميقة، مما يؤدي إلى انخفاض السعة.

 

يقدم توماسن وآخرون مثالاً جيدًا لتوضيح NFF. يستخدم في عملية إنتاج فيروس شلل الأطفال المعطل (IPV). تم استخدام خلايا Vero المزروعة على حاملات دقيقة لتكاثر الفيروس بكثافة خلايا تبلغ {{0}}.78 × 106 خلية / مل TOI. يتم استخدام شاشة من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 75 ميكرومتر للتوضيح المسبق لإزالة الحاملات الدقيقة من الحصاد. يتم توضيح التصنيف ثنائي الطبقة باستخدام مرشح عميق الكثافة (0.2-2.0 ميكرومتر)، متبوعًا بمرشح درجة معقم.

تم استخدام الوحدة القابلة للتطوير المختارة بنجاح لإعداد مادة التجارب السريرية للقاح شلل الأطفال المعطل من إنتاج شركة Sabin بمقياس 350 لترًا. اعتمادًا على النمط المصلي للفيروس، يتم الحصول على معدل شفاء للفيروس يتراوح بين 86 و96 بالمائة.

 

2.2.1.3 الجسيمات الشبيهة بالفيروسات/الفيروسات التي تنتج في نظام الخلية الحشرية

إن دراسة أنظمة الخلايا الحشرية/الفيروسية لإنتاج اللقاحات على نطاق واسع أمر جديد نسبيًا، ولكنه يجذب اهتمامًا متزايدًا في مجال النواقل الفيروسية وVLPs. والفائدة الرئيسية لهذا النظام هي أنه ينطوي على إنتاج قصير الأجل (لا حاجة إلى إنشاء سلالات خلوية) وآمن (لا يوجد حمض نووي فيروسي كامل). وهناك أيضًا بعض العيوب، مثل الحاجة إلى إزالة الفيروس الحشري واستقرار المنتج.

 

إن لقاح سيرفاريكس، وهو لقاح VLP ضد عدوى فيروس الورم الحليمي البشري أنتجته شركة جلاكسو سميث كلاين، هو أول لقاح بشري يتم إنتاجه تجاريًا في خلايا الحشرات. وهناك عدد من اللقاحات القائمة على VLPs وrAAV المنتجة في خلايا الحشرات المصابة بفيروس الورم الحليمي البشري قيد التطوير حاليًا. وتعتبر سلالات الخلايا الحشرية المشتقة من دودة جيش الخريف Spodoptera frugiperda (Sf9 وSf21) ودودة الملفوف Trichoplusia ni (خلايا BTI-TN5B1-4) هي الأكثر استخدامًا بسبب قدرتها على النمو في التعليق، مما يبسط تضخيم العملية السابقة. وبعد النمو إلى الكثافة المطلوبة من الخلايا الحية، تُصاب هذه الخلايا بفيروس باكولوفيروس المعاد تركيبه في مرحلة النمو الخلوي الأسي للتعبير عن البروتين. ويسمح الجينوم الكبير لفيروسات باكولوفيروس بالتعبير عن خمسة بروتينات مختلفة أو أكثر، وهو ما يتوافق مع تعقيد VLP والناقلات الفيروسية.

 

وصف برنارد وآخرون العملية التالية لزراعة خلايا الحشرات. العملية متغيرة للغاية، مما يعكس تنوع البروتينات المنتجة بهذه التقنية. تتأثر الخطوة الأولى من تسلسل التنقية بشكل كبير بخصائص حجم المفاعل الحيوي (أي كثافة الخلايا وقابليتها للحياة)، أو بطبيعة إطلاق المنتج (الذي يفرز عن طريق التبرعم أو انحلال الخلايا). يمكن أن تتسبب عدوى الفيروس العصوي لخلايا الحشرات في انحلال الخلايا في غضون 3-5 يوم. قد يؤدي تدمير الخلايا إلى زيادة النشاط التحللي البروتيني وعوامل بيئية أخرى يمكن أن تؤدي إلى تحلل البروتينات المعاد تركيبها.

كانت هناك محاولات لتطوير فيروسات حشرية ذات قدرة أقل على بدء تحلل الخلايا. حيث تقوم الفيروسات الحشرية بتحلل أقل من 10% من الحشرات المصابة.

 

يمكن إجراء تحلل الخلايا باستخدام طرق مختلفة، مثل التجميد والذوبان، والمنظفات، والمجانسات، أو العلاج بالموجات فوق الصوتية. لا تحتوي خلايا الحشرات على جدار خلوي وبالتالي تذوب بسرعة. على الرغم من الإبلاغ عن العلاج بالموجات فوق الصوتية في العديد من عمليات المختبر، إلا أنه نادرًا ما يستخدم على نطاق تجريبي أو تجاري. الطريقة الأكثر شيوعًا هي استخدام المجانسة لتدمير الخلايا في وجود منظف منخفض التركيز (0.1٪ Triton X-100 أو NP-40). تم استخدام المنظفات والميكروفلويديزيشن أو التجانس بالتأثير الأسموزي بنجاح في العديد من عمليات التصنيع واسعة النطاق. عادةً، يتم تعليق خلايا الحشرات في مخازن التحلل (50 mM TRIS pH7.7، 30 mM NaCl، 5% glycerol، 0.2 mM PMSF، ومثبطات البروتيناز)، وخلال هذه العملية، تتم إضافة Triton-X100 إلى تركيز نهائي يبلغ 0.1%، يليه الموجات فوق الصوتية الخفيفة أو الميكروفلويدات. ثم يتم طرد الخليط بالطرد المركزي لإزالة الجسيمات غير القابلة للذوبان.

 

في هذه المرحلة، قد يبدو المحلول غائمًا جدًا ويصعب ترشيحه باستخدام مرشح 0.45μm. في بعض الأحيان، يمكن ملاحظة خسائر تصل إلى 30% أثناء خطوة توضيح التحلل الحراري. تساعد إضافة البنزوإنزيمات في مرحلة الانقسام في حل مشكلة الترشيح. يساعد تنظيف الخلايا بمحلول ملحي منظم بالفوسفات بعد الحصاد و"التجميد والذوبان" السريع في محلول ملحي عالي (500 مليمولار كلوريد الصوديوم) يحتوي على محلول التكسير على إزالة الكتل.

 

يحدث توضيح VLPs والناقلات الفيروسية التي تنتجها خلايا الحشرات بعد تحلل الخلايا (عن طريق المعالجة الكيميائية أو الميكانيكية)، والتي لا تطلق الجسيمات الفيروسية فحسب، بل تطلق أيضًا كميات كبيرة من الأحماض النووية الخلوية. تستطيع خلايا الحشرات النمو بكثافة خلوية عالية، من 1-9.10 6 خلية/مل. لذلك، يجب أن تتعامل خطوة التوضيح مع الكثافة الخلوية العالية، ومحتوى الأحماض النووية العالي، وإذا أمكن، إزالة جزيئات الفيروس الحشري. ولجعل الأمور أكثر تعقيدًا، يمكن أن يكون لـ VLPs أو النواقل الفيروسية والفيروسات الحشرية أحجام متشابهة (يبلغ عرض الفيروسات الحشرية 60-80 نانومتر وطولها 300-400 نانومتر). ونظرًا للكثافة الخلوية العالية، كانت الطرد المركزي هي التقنية المفضلة للتوضيح الأولي لعقود من الزمان. ومع ذلك، يبدو أن عمليات الغشاء بديل جذاب للغاية لأن قابلية التوسع يسهل تعريفها.

 

تم استخدام المرشحات العميقة بشكل فعال في العملية اللاحقة لجسيمات ثلاثية الطبقات تشبه الفيروس العجلوي. على مستوى المختبر، غالبًا ما تُستخدم طريقة الطرد المركزي لتدرج كثافة كلوريد السيزيوم لتنقية هذه الجسيمات المعقدة. لم يقم الباحثون بتقييم خطوة التوضيح للمرشح العميق فحسب، بل قاموا أيضًا بتقييم العملية اللاحقة بالكامل (انقسام تريتون إكس -100 والترشيح العميق، متبوعًا بالترشيح الفائق واستبعاد حجم الجسيمات). تظهر النتائج أن إنتاج تدرج كثافة كلوريد السيزيوم يمكن أن يصل إلى 37٪.

تبلغ نسبة الطرد المركزي الفائق حوالي 10%. وكمثال آخر، تم استخدام ألياف مجوفة بسمك 0.45 ميكرومتر وألياف ذات قطر دقيق يبلغ 500 كيلو دالتون لاستعادة وتركيز الجسيمات الشبيهة بفيروس نقص المناعة البشرية المنتجة في خلايا الحشرات. في هذه الدراسة، تم تحسين قوة القص للألياف المجوفة بناءً على سلامة الخلية. النتائج تم إنشاء عملية ذات قوة قص منخفضة لتحل محل الطرد المركزي الفائق لتدرج سكر المائدة.

 

تتمتع هذه العملية بإمكانية تطبيقها على الإنتاج الضخم. كما تم استخدام المرشحات العميقة بنجاح في إنتاج الفيروسات الغدية المعاد تركيبها. تم إجراء تحلل الخلايا باستخدام جهاز تشويش خلوي ميكانيكي ثنائي المكبس، متبوعًا بمعالجة نوكلياز. في خطوة التوضيح، تم استخدام عنصر مرشح عميق من الألياف الزجاجية بقطر 1.2 ميكرومتر، متبوعًا بطبقتين من PES محبة للماء بقطر 0.8 ميكرومتر وPES محبة للماء بقطر 0.2 ميكرومتر. تُستخدم المرشحات ذات الحجم المتناسب لدفعات المعالجة من الأحجام الأصغر إلى 200 لتر. تم استخدام المرشحات العميقة بنجاح، كما تم الإبلاغ عن أن تصنيفات TFF ذات الأغشية المسطحة أو الألياف المجوفة بقطر 0.2 ميكرومتر أو 0.45 ميكرومتر فعالة للغاية.

 

استخدمت الدراسة التي أجراها معهد تيكنولوجيكا (IBET) في معهد أويراس للبيولوجيا التجريبية في البرتغال تقنية NFF لتوضيح VLP لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي المعبر عنه بواسطة الفيروسات العصوية دون الطرد المركزي. تُستخدم مرشحات البولي بروبلين المصنفة اسميًا (10،50.6 و0.3μm) لتوضيح حصاد VLP. تُستخدم نفس المرشحات ذات تصنيفات المسام 0.6μm و0.3μm للترشيح في مراكز حصاد VLP. تم اختبار جميع المرشحات المدروسة لمعرفة معدلات استرداد VLP لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي وتمت مقارنة طرق الترشيح الموصى بها. تظهر النتائج في الجدول 4.

أظهرت النتائج أن مرشح 5μm-0.3μm كان له أعلى معدل استرداد للمنتج (100٪) لتغذية VLP لفيروس التهاب الكبد C المحصودة مباشرة. كان مرشح البولي بروبيلين 0.6μm أعلى معدل استرداد للمنتج (82٪) للتغذية المركزية، وكان تطهير الحمض النووي للخلية المضيفة حوالي 70٪.

 

2.2.1.4 جزيئات شبيهة بالفيروسات تنتج في أنظمة بكتيرية أو خميرة

يعتمد نوع طريقة التوضيح للقاحات VLP المعبر عنها في أنظمة بكتيرية أو خميرة على إطلاق VLP إلى وسطاء خارج الخلية. إذا لم يكن من الممكن إفراز VLP بكفاءة، فقد تكون هناك حاجة إلى تحلل الخلايا أو خطوات استخلاص أخرى قبل خطوة التوضيح الفعلية. في حين أن هذا هو المعيار الذهبي في صناعة توضيح البروتين، فإن الطرد المركزي (المستمر أو الدفعة) المعبر عنه في أنظمة تعتمد على البكتيريا أو الخميرة، أصبحت عمليات الغشاء مؤخرًا بديلاً جذابًا للغاية نظرًا لسهولة التوسع والتوافق مع العلاجات ذات الاستخدام الفردي.

 

يشرح ريتشر وتوبل استخدام الطرد المركزي أو TFF أو مزيج من الاثنين عند تحضير VLPs المنتجة في E. coli الموضحة. في عملهم، تم استخدام أغشية TFF بحجم 0.45m لتخفيف وتوضيح متجانسات E. coli المتجانسة عند درجة حرارة 5 درجات. كما لاحظوا أن TFF القائم على الغشاء مناسب للتعامل مع الحصادات عالية اللزوجة، ويفضل استخدام وحدات TFF ذات تكوينات القناة المفتوحة.

تم تقييم التوضيح بالطرد المركزي أيضًا كبديل لـ TFF. في هذه الحالة، لم يتم تخفيف المتجانس الناتج وتم طرده مركزيًا عند 4 درجات لمدة 105 دقيقة، 10000 جرام. بدون نقل الطلاء الناعم، تم سكب السائل العلوي من الجسيمات وإعادة طرده مركزيًا عند 4 درجات و 10000 جرام لمدة 60 دقيقة. ثم تمت إزالة السائل العلوي من الجسيمات الحالية، وتم تخفيفه بمحلول EB (43.89 مللي مولار Tris HCl، 6.11 مللي مولار Tris Base، 5.0 مللي مولار EDTA، 10٪ (حجم / حجم) Triton X-100) 1: 2، وتم ترشيحه على جهاز ترشيح معقم 0.22 م. مزيد من المعالجة. وبحسب ما ورد، تم توضيح عملية توسيع نطاق إنتاج لقاح VLP هذا في E. coli على نطاق 800 لتر من خلال الجمع بين الطرد المركزي و TFF.

 

تم ترخيص لقاح التهاب الكبد E المعاد تركيبه HEV 239 في الصين لتحصين البالغين الذين تبلغ أعمارهم 16 عامًا أو أكثر. يتم التعبير عن مستضدات اللقاح (VLP) في E. coli، وقد ثبت أن توسيع نطاق عملية إنتاج المستضد يكون على مقياس 50 لتر. تم استخراج المنتج عن طريق تكسير E. coli وتم فصل الأجسام المتضمنة عن شظايا الخلايا عن طريق الغسيل الثقيل بمحلول يحتوي على 2٪ Triton X-100 ثم تم إذابته باستخدام متجانس اليوريا 4 M. يوضح TFF مستضد VLP لفيروس الورم الحليمي البشري المنتج في Saccharomyces cerevisiae (15 لترًا). تم توضيح مستخلص الخلية المعالج بالنوكلياز عن طريق الترشيح الدقيق المتقاطع في وضع الترشيح باستخدام مرشح ألياف مجوفة 0.65 ميكرومتر. تُستخدم نفس العملية في إنتاج اللقاح. على الرغم من أن عددًا قليلًا من اللقاحات المعتمدة على VLP قد وصلت إلى النطاق التجاري، إلا أن العديد من اللقاحات المعتمدة على VLP قيد التطوير، ومعظمها يتم توضيحه باستخدام تقنية الطرد المركزي أو الغشاء.

 

وبسبب محدودية تأثير المساحة، سنشارك النصف الثاني من المحتوى في الفصل التالي. وفي المقالة التالية، سنشارك بعض حالات توضيح اللقاح واستخدام مكونات الغشاء ذات الصلة.

 

باعتبارها الشركة الأولى في دائرة التوطين، اكتسبت Guidling Technology خبرة كافية ذات صلة بتوضيح اللقاحات. Guidling Technology هي شركة تطوير وإنتاج تركز على المستحضرات الصيدلانية الحيوية وزراعة الخلايا والتطهير والفصل. تُستخدم المنتجات على نطاق واسع في الطب الحيوي والتشخيص وتصفية السوائل الصناعية والكشف والتوضيح والتطهير وعملية التركيز؛ طورت Guidling بنجاح أنبوب الطرد المركزي للترشيح الفائق، وشريط غشاء الترشيح الفائق/الترشيح الدقيق، ومرشح إزالة الفيروسات، وجهاز مرشح التدفق المماسي، ومكدس الغشاء العميق، وما إلى ذلك، والتي تلبي تمامًا سيناريوهات تطبيق المستحضرات الصيدلانية الحيوية وزراعة الخلايا.

 

تُستخدم أغشيتنا ومرشحاتنا الغشائية على نطاق واسع في التركيز والاستخلاص وفصل الترشيح المسبق والترشيح الدقيق والترشيح الفائق والترشيح النانوي. يمكن لمجموعة منتجاتنا الواسعة النطاق، من الترشيح المعملي الصغير للاستخدام الفردي إلى أنظمة الترشيح من النوع الإنتاجي واختبار التعقيم والتخمير وزراعة الخلايا والمزيد، تلبية احتياجات الاختبار والإنتاج.