تطبيق الترشيح الفائق في إنتاج لقاح داء الكلب البشري

من أجل تعزيز تطبيق الترشيح الفائق في إنتاج لقاح داء الكلب البشري، تم استخدام كاسيت غشاء الترشيح الفائق 300 كيلو دالتون لتركيز محلول حصاد فيروس داء الكلب واكتشاف استرداد المستضد ومعدل إزالة السموم الداخلية ومعدل إزالة البروتين المضيف بعد الترشيح الفائق. أظهرت النتائج أنه تحت الضغط المناسب، تم تركيز محلول حصاد فيروس داء الكلب 80 مرة، وتم التصفية 25 مرة، وكان معدل استرداد المستضد 86.2%، وكان معدل إزالة السموم الداخلية البكتيرية 87.5% ~ 88.7%، و وكان معدل إزالة البروتين المضيف 91.6٪.

 

مقدمة

 

داء الكلب هو مرض حيواني المنشأ تقليدي وقديم يسببه فيروس داء الكلب (RV)، ويصل معدل الوفيات إلى 100%. في الوقت الحاضر، لا يوجد علاج فعال لمرحلة ما بعد التعرض (أي تلف الجلد والأغشية المخاطية) بخلاف لقاح الطوارئ والتطعيم بالجلوبيولين المناعي. المصدر الرئيسي لداء الكلب لدى البشر هو عضات الحيوانات المريضة أو التي يحتمل أن تكون مصابة (الكلاب بشكل رئيسي). يحتل معدل الوفيات بسبب داء الكلب في الصين المرتبة الثانية في العالم، ويعد داء الكلب إحدى المشاكل التي تهدد أمن الصحة العامة في بلادنا. كان البروتين السكري المحفظي لفيروس داء الكلب، وهو المستضد الرئيسي الوحيد الذي يحفز إنتاج الأجسام المضادة المحايدة الوقائية، محور البحث وتطوير لقاحات جديدة وتقنيات تشخيص وعلاج جديدة لفيروس داء الكلب.

 

ينتمي فيروس داء الكلب إلى جنس فيروس داء الكلب من عائلة الفيروسات الربدية. شكل القفيصة النووية مرن، والقفيصة النووية متناظرة حلزونيًا، والسطح له غلاف يحتوي على RNA أحادي الجديلة. إنه العامل الممرض الذي يسبب داء الكلب. يحتوي فيروس داء الكلب على مستضدين رئيسيين: أحدهما هو مستضد البروتين السكري الموجود على الغشاء الخارجي للفيروس، والذي يمكن أن يرتبط بمستقبل الأسيتيل كولين ليجعل الفيروس سامًا للأعصاب، وينتج أجسامًا مضادة معادلة وأجسامًا مضادة مثبطة للتراص الدموي في الجسم، وتكون الأجسام المضادة المعادلة لها تأثير وقائي والآخر هو مستضد البروتين الريبي الداخلي، والذي يمكن أن يجعل الجسم ينتج أجسامًا مضادة مكملة ومركبًا، وليس له أي تأثير وقائي.

 

الذيفان الداخلي هو نوع من مادة عديد السكاريد الدهني (LPS)، التي تتميز بمقاومة الحرارة والاستقرار الكيميائي وليس من السهل تدميرها. إذا كان هناك تركيز معين من الذيفان الداخلي في اللقاح، فسوف يسبب حمى شديدة وحتى الوفاة بعد التطعيم، لذلك يجب تقليل محتوى الذيفان الداخلي في اللقاح قدر الإمكان. حددت طبعة عام 2005 من دستور الأدوية الصيني (الجزء الثالث) أن قيمة التحكم للمؤشر المؤهل للسموم الداخلية للقاح داء الكلب يجب ألا تكون أعلى من 100 وحدة دولية/جرعة. مع التطور السريع لتكنولوجيا فصل الغشاء، أصبح تطبيق تكنولوجيا فصل غشاء الترشيح الفائق لتقليل محتوى السموم الداخلية في اللقاحات منتشرًا بشكل متزايد في صناعة الأدوية.

 

لقاح داء الكلب هو لقاح ضد داء الكلب. هناك عادة ثلاثة أنواع من لقاحات داء الكلب، بما في ذلك لقاح خلايا فيرو المنقى، ولقاح الخلايا الثنائية الصبغية البشرية، ولقاح زراعة الخلايا الأولية. يتم تصنيع لقاح داء الكلب عن طريق حقن الفيروس الثابت لفيروس داء الكلب في المصفوفة الخلوية، بعد الزراعة والحصاد والتركيز والتعطيل والتنقية وإضافة المثبت المناسب. وتتمثل المهمة الرئيسية للقاح داء الكلب في تحفيز الجسم لإنتاج استجابة مناعية سريعة وإنتاج أجسام مضادة وقائية ضد فيروس داء الكلب، وذلك لمنع العدوى التي يسببها الفيروس وتقليل خطر الإصابة بالمرض.

 

 

تلعب عملية إنتاج اللقاح دورا هاما في ضمان جودة اللقاح، وخاصة أن القياس الكمي لبعض المؤشرات في عملية الإنتاج هو الأكثر أهمية. في عملية إنتاج لقاح داء الكلب البشري، تعد تكنولوجيا تركيز الترشيح الفائق وسيلة ضرورية لإنتاج لقاح داء الكلب البشري. إن استخدام غشاء الترشيح الفائق ذو الفتحة المعقولة لتركيز الترشيح الفائق يمكن أن يزيل السموم الداخلية والبروتين المضيف بشكل فعال، ويحتفظ بمستضد RV، مما يفضي إلى إنتاج اللقاح وتحسين الجودة. تبلغ الكتلة الجزيئية النسبية لجزيئات RV 350 كيلو دالتون ~ 460 كيلو دالتون، ومن الناحية النظرية، يمكن احتجاز RV بالكامل عن طريق تركيز الترشيح الفائق باستخدام كاسيت غشائي بوزن جزيئي اعتراضي يبلغ 100 كيلو دالتون و300 كيلو دالتون. غالبًا ما يشكل الذيفان الداخلي بنية مجمعة في المحاليل المائية المختلفة، نظرًا لدرجة التجميع، يختلف الحجم الجزيئي. الكتلة الجزيئية النسبية لمونومر الذيفان الداخلي هي 10kDa ~ 20kDa، والكتلة الجزيئية النسبية لشكل البلمرة هي 300kDa ~ 1000kDa أو أكثر من 1000kDa. استنادا إلى الفرق في الوزن الجزيئي، تم الاحتفاظ بمستضد RV في لقاح داء الكلب البشري وتمت إزالة الذيفان الداخلي والبروتين المضيف في لقاح داء الكلب البشري بواسطة غشاء الترشيح الفائق 300 كيلو دالتون.

 

في هذه التجربة، تم استخدام كاسيت غشاء الترشيح الفائق بفتحة 300 كيلو دالتون ومساحة غشاء 0.11 م2 كعلاج لعينة صغيرة لتركيز المنتجات الوسيطة للقاح داء الكلب البشري، وتدفق الغشاء، وكفاءة العلاج، والتركيز المتعدد، واعتراض المستضد، وإزالة السموم الداخلية وتم اختبار إزالة البروتين المضيف.

 

2طريقة المواد

 

2.1 المواد التجريبية

فيروس داء الكلب سلالة فيروس CTN-IV الثابتة؛ خلايا فيرو؛ 0.5M هيدروكسيد الصوديوم؛ 30 كاسيت غشاء الترشيح الفائق 0 كيلو دالتون (مادة PES، مساحة الغشاء 0.11 م²).

 

2.2 الطرق التجريبية

2.2.1 إعداد محلول حصاد الفيروس

تم إنعاش خلايا فيرو المجمدة في ماء دافئ عند درجة حرارة 37 درجة ~ 39 درجة، وتم رشف الخلية المعلقة، ثم إضافتها إلى 199 وسط استزراع يحتوي على 10% من مصل العجل المعطل. تم زراعة خلايا أحادية الطبقة موحدة عند 37 درجة. تم تلقيح سلالة CTN-IV بفيروس داء الكلب بنسبة 0.1mol/L وزرعت عند درجة حرارة 37 درجة. بعد 48 ساعة، تم التخلص من وسط الاستزراع وأضيف 199 وسط استزراع يحتوي على 0.1% من ألبومين الدم البشري للحفاظ على الاستزراع عند 33 درجة ~ 35 درجة. احصد سم المرض مرة واحدة كل ثلاثة أيام، واجمع سوائل الحصاد المتعددة.

 

2.2.2 تركيب شريط الكاسيت

قم بتثبيت شريط الغشاء وقم بتوصيل الأسلاك كما هو موضح في الشكل أدناه.

 

2.2.3 الغسيل المائي

أغلق صمام المدخل وصمام العودة والصمام من خلال الصمام، وأدخل طرف الإرجاع ومن خلال الأنبوب النهائي في خزان النفايات السائلة. املأ خزان السحب بـ 1 لتر من الماء للحقن.

افتح صمامات الدخول والرجوع، وأغلق الصمامات البينية، وافتح المضخة، ونظف خط الإرجاع بنسبة 10% من الماء النقي أو الماء المخصص للحقن، وحافظ على ضغط المدخل عند 0.35 بار (5 رطل لكل بوصة مربعة).

افتح صمام الفلتر، وأغلق صمام الإرجاع، واستخدم ماء الحقن المتبقي لتنظيف أنبوب الفلتر، مع الحفاظ على TMP عند 0.35bar.

 

2.2.4 التطهير

أغلق صمام المدخل وصمام العودة وصمام النقل، وأدخل طرف العودة وخطوط نهاية النقل في خزان النفايات السائلة. املأ خزان السحب بـ 2 لتر من محلول التنظيف.

افتح صمامات الدخول والرجوع، وأغلق الصمامات النفاذة، وافتح المضخة، ونظف خط الإرجاع باستخدام 200مل من 0.5 مل من هيدروكسيد الصوديوم، وحافظ على ضغط المدخل عند 0.35 بار (5 رطل لكل بوصة مربعة) .

افتح الصمام الشفاف، وأغلق صمام الإرجاع، ونظف الأنبوب النفاذ بحجم 200 مل من محلول التنظيف، مع الحفاظ على TMP عند 0.35 بار.

ثم يتم إدخال طرف الإرجاع والأنبوب النهائي في خزان السائل للتنظيف الدوري. دورة التنظيف بمعدل 1 ~ 1.5 مرة من معدل التدفق العرضي للعملية لمدة 30 دقيقة.

قم بتصريف 0.5M من هيدروكسيد الصوديوم وشطفه بالماء للحقن وفقًا لـ 2.2.4 حتى يصبح محايدًا.

 

2.2.5 اختبار تدفق المياه

أضف الماء النقي إلى خزان السحب، وقم بقياس وتسجيل درجة حرارة الماء في خزان السحب. أدخل نهاية العودة في الخزان. ابدأ تشغيل المضخة واضبط سرعة المضخة وصمام الرجوع لتحقيق فرق ضغط الغشاء 0.35bar (5psi). باستخدام اسطوانة، قم بقياس وتسجيل معدل التدفق عند النهاية بمل/دقيقة. ضبط سرعة المضخة وصمام العودة للحصول على 1bar (15psi) الضغط التفاضلي عبر الغشاء. باستخدام اسطوانة، قم بقياس وتسجيل معدل التدفق عند النهاية بمل/دقيقة.

لتوحيد قيمة تدفق المياه، قم بتقسيم قيمة تدفق المياه المحسوبة على فرق ضغط الغشاء وضرب عامل تصحيح درجة الحرارة في الجدول التالي.

 

2.2.6 تركيز الترشيح الفائق

اغسل الماء خارج النظام باستخدام الجزء العلوي العازل. دورة لمدة 5 دقائق لضبط درجة الحموضة واستقرار الأيون في النظام. إذا كانت درجة الحرارة بحاجة إلى تعديل، فاستمر في الدورة حتى تستقر درجة حرارة النظام.

أضف سائل التغذية إلى خزان السحب، واضبط معدل تدفق التغذية (على سبيل المثال 400LMH)، واختبر معدل التدفق خلال قيم TMP مختلفة. وفقا لبيانات الاختبار، تم رسم المنحنيات باستخدام TMP كالإحداثي الإحداثي والتدفق كالإحداثي.

قم بتوجيه الأنبوب من خلال النهاية إلى حاوية أو مصرف مناسب، مثل صهاريج التجميع من خلال النهاية، وخزانات النفايات السائلة، ومصارف المعالجة.

سجل الوزن الأولي لسائل التغذية في خزان التغذية، وابدأ تشغيل مضخة التغذية، وقم بتدوير سائل التغذية ببطء لمدة تتراوح بين 3 دقائق و4 دقائق. يمكن أن تساعد إعادة التدوير في إزالة الهواء المتبقي في مسار التدفق، وبالتالي زيادة أداء الفيلم إلى الحد الأقصى.

افتح الصمام خلاله، وقم بزيادة سرعة المضخة ببطء حتى يتم الوصول إلى معدل التدفق العرضي الأمثل، واضبط صمام العودة لتحقيق TMP الأمثل للنظام.

ثم ضع الأنبوب في حاوية التجميع، وابدأ التوقيت عندما يدخل السائل إلى الحاوية، وسجل ضغط الدخول والرجوع على فترات مناسبة، وسجل جودة السائل مع مرور الوقت عند طرف العودة والنهاية لحساب اللحظية معدل المد و الجزر.

يكتمل تركيز الترشيح الفائق للعينة عندما يتم تقليل حجم سائل التغذية إلى حجم التركيز المستهدف.

 

2.2.7 غسيل الكلى

ضع أنبوب السحب وأنبوب التجديد وأنبوب الإرجاع في خزان السحب، ثم ضع أنبوب النقل في حاوية التجميع، ثم ضع حاوية التجميع على الميزان لتطهيرها.

افتح صمام الإرجاع، وابدأ تشغيل مضخة الإدخال، وافتح الصمام خلاله، واضبط سرعة المضخة وTMP إلى القيمة المناسبة. افتح مضخة التجديد، وحافظ على حجم السائل في خزان السحب دون تغيير، وابدأ عملية غسيل الكلى ذات الحجم المتساوي. بدء التوقيت عندما يدخل السائل إلى الحاوية، وتسجيل الضغط عند نهاية المدخل ونهاية العودة وكتلة السائل في الفاصل الزمني المناسب، والحصول على معدل التدفق اللحظي عن طريق الحساب.

 

2.2.8 التنظيف المكاني

أولا شطف مع العازلة، ثم شطف بالماء للحقن (العملية 2.2.3)، ثم تنظيف مع عامل التنظيف (العملية 2.2.4)، وأخيرا شطف بالماء للحقن (العملية 2.2.3).

 

2.2.9 اختبار تدفق المياه

العملية هي كما يلي: 2.4.5.

 

2.2.10 الحفاظ على غشاء الكاسيت

تخزين قصير المدى (أقل من أو يساوي 3 أيام)، احتفظ بشريط الغشاء في التركيب واستخدم محلول التخزين للدوران لمدة 10 دقائق إلى 15 دقيقة، وأغلق صمام النظام، واقطع مصدر الطاقة عن مضخة السائل، وتأكد من أن خزان مدخل السائل مغلق بشكل صحيح.

إذا كانت مدة التخزين تتراوح من 3 أيام إلى شهر واحد، فيرجى إزالة شريط الغشاء من الجهاز وإغلاقه في كيس بلاستيكي أو حاوية أخرى محكمة الإغلاق. أضف حوالي 50 مل إلى 100 مل من محلول التخزين إلى كيس بلاستيكي أو حاوية محكمة الإغلاق وأغلقها. أو يمكن غمرها مباشرة في محلول التخزين. يوصي الجدول التالي بظروف التخزين.

 

3 النتائج والتحليل

 

3.1 دراسة العوامل المؤثرة على كفاءة إزالة البيروجين

ضغط عملية الترشيح الفائق: تم تشغيل 15 دفعة اختبار بشكل مستمر. في كل دفعة، تم الحفاظ على ضغط الترشيح عند 5 و10 و15 و2{{10}} رطل لكل بوصة مربعة أثناء الترشيح الفائق، وتم تركيز سائل حصاد الفيروس 30 مرة وإزالته بسائل عازل (10 أضعاف الحجم) في تدفق مستمر. النتائج كما هو موضح في الجدول أدناه، كان معدل إزالة الذيفان الداخلي أقل من 87.0%، وكان معدل استرداد المستضد مستقرًا عند 86.0%، وكان معدل إزالة البروتين المضيف مستقرًا عند 90.0%، مما يشير إلى أن ضغوط التشغيل المختلفة كان لها تأثير ضئيل على تأثير استعادة المستضد وإزالة السموم الداخلية وإزالة البروتين المضيف.

نسبة تركيز الترشيح الفائق: تم تشغيل 15 دفعة اختبار بشكل مستمر. في كل دفعة، تم تركيز سائل حصاد الفيروس 30 مرات، و50 مرات، و80 مرة، و100 مرة على التوالي أثناء الترشيح الفائق. تم الحفاظ على ضغط الترشيح عند 20 رطل لكل بوصة مربعة، وتم شطف السائل العازل (10 أضعاف الحجم) بالتدفق المستمر. النتائج كما هو موضح في الجدول التالي، تراوح معدل إزالة السموم الداخلية من 53.3% إلى 86.9%، وظل معدل استرداد المستضد ثابتًا عند 86.0%، ومعدل إزالة البروتين المضيف واستقر عند 91.0%. في أخذ العينات المجزأة، لم يتم اكتشاف أي مستضد في محلول النقل، وبقي أقل من 10% من البروتين المضيف في محلول الفيروس المركز. يزداد تركيز الذيفان الداخلي في المحلول المركز للفيروس مع زيادة مرات التركيز، وكان معدل إزالة الذيفان الداخلي هو الأعلى في العينة المركزة 80 مرة، كما يمكن للشركة المصنعة أن تأخذ في الاعتبار تركيز 100 مرة، وهو ما لا يقتصر فقط على حسنت كفاءة الإنتاج وخفضت التكلفة، ولكنها استوفت أيضًا متطلبات إنتاج اللقاح.

 

3.2 استنزاف تدفق غشاء الكاسيت وتجديد التنظيف

بعد العلاج، كان معدل استرداد تدفق الغشاء 92.6٪. يعد معدل الاسترداد الأول لشريط الغشاء الجديد أمرًا طبيعيًا، وفقًا لخصائص المراقبة الحالية لسائل التغذية، والتنبؤ اللاحق للأوقات الثانية وNTH، سيكون معدل استرداد تدفق شريط الكاسيت قريبًا من البيانات بعد هذا العلاج، و تميل إلى أن تكون مستقرة. خلال ساعتين من الاستخدام الفردي، كان استنفاد شريط الكاسيت الغشائي مثاليًا، وتم استنفاد 10٪ فقط من تدفق الغشاء في ظل التشغيل الشامل.

3.2.1 استنفاد التدفق في عملية معالجة كاسيت الغشاء

3.2.2 نتيجة تنظيف وتجديد شريط الكاسيت الغشائي

 

حول غيدلينغ

 

Guidling Technology هي مؤسسة وطنية ذات تقنية عالية تركز على المستحضرات الصيدلانية الحيوية وزراعة الخلايا وتنقية وتركيز الطب الحيوي والتشخيص والسوائل الصناعية. لقد نجحنا في تطوير أجهزة تصفية الطرد المركزي، وأشرطة الترشيح الفائق والترشيح الدقيق، ومرشح الفيروسات، ونظام TFF، ومرشح العمق، والألياف المجوفة، وما إلى ذلك. والتي تلبي تمامًا سيناريوهات تطبيق المستحضرات الصيدلانية الحيوية، وثقافة الخلايا، وما إلى ذلك. تُستخدم الأغشية والمرشحات الغشائية الخاصة بنا على نطاق واسع في التركيز والاستخلاص والفصل للترشيح المسبق والترشيح الدقيق والترشيح الفائق والترشيح النانوي. تلبي خطوط منتجاتنا العديدة، بدءًا من الترشيح المعملي الصغير ذو الاستخدام الواحد وحتى أنظمة ترشيح الإنتاج واختبار العقم والتخمير وزراعة الخلايا، احتياجات الاختبار والإنتاج. تتطلع شركة Guidling Technology إلى التعاون معك!