تكنولوجيا تعطيل وإزالة الفيروسات من منتجات الدم

Oct 24, 2024

منتجات الدم هي "مكونات بروتين البلازما أو مكونات خلايا الدم، مثل ألبومين الدم البشري، والجلوبيولين المناعي البشري، وعامل التخثر البشري (الطبيعي أو المؤتلف)، وتركيز خلايا الدم الحمراء، وما إلى ذلك، مفصولة عن البلازما البشرية السليمة أو البلازما البشرية المناعية على وجه التحديد، المنقاة أو مصنوعة بواسطة تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف، للتشخيص أو العلاج أو الوقاية المناعية السلبية. تلعب منتجات الدم دورًا مهمًا في حالات الطوارئ الطبية وإنقاذ إصابات الحرب والوقاية من بعض الأمراض المحددة وعلاجها.

يجب أن تضمن ممارسات ضمان السلامة أن الدواء النهائي آمن للجهات التنظيمية، وفي نهاية المطاف، للمرضى والجمهور. في التسعينيات، أصدر مؤتمر التنسيق الدولي (ICH 1998) "السؤال 5A: تقييم السلامة الفيروسية لمنتجات التكنولوجيا الحيوية من خطوط الخلايا البشرية أو الحيوانية الأصل" (Q5A: تقييم السلامة الفيروسية)، ووضع معيار عالمي للسلامة الفيروسية.

يصف ICH Q5A مخططًا متعدد المستويات للاختبار والتحقق من الصحة لتحقيق هذا الهدف. يركز برنامج الاختبار على بنك الخلايا والمواد الخام وحصاد المفاعلات الحيوية، ويكمله تحليل مخاطر المنتج. بالإضافة إلى الاختبار، يتطلب ICH Q5A تقييم إزالة التلوث في اتجاه مجرى النهر كإجراء آمن من الفشل عند عدم اكتشاف أي ملوثات في اتجاه مجرى النهر. يضمن التحقق من التخليص أنه في حالة تهرب أي فيروس من نظام الاختبار، يمكن إزالته و/أو تعطيله قبل أن ينتهي به الأمر في المنتج الدوائي النهائي.

في تصنيع التكنولوجيا الحيوية الحديثة (أو المعالجة الحيوية)، عادة ما تكون هناك ثلاث أو أربع عمليات وحدة في التسلسل المنقى بأكمله، قادرة على إزالة الفيروس أو تعطيله. يتضمن ذلك بعض الخطوات الكروماتوغرافية (مثل البروتين A أو تبادل الأنيونات)، وثقافة انخفاض الرقم الهيدروجيني أو المنظفات، ومرشحات احتجاز الفيروسات. لن تؤدي كل هذه الخطوات إلى إزالة جميع الفيروسات أو إلغاء تنشيطها بشكل فعال.

على سبيل المثال، عادة ما تكون ثقافة الرقم الهيدروجيني المنخفضة غير فعالة لتعطيل الفيروس غير المغلف، ولكنها تعمل بشكل جيد لتعطيل الفيروس المغلف. في ظل ظروف تشغيل معينة، قد لا يتمكن عمود التبادل الأنيوني من ربط وإزالة الفيروسات العازلة الكهربية المحايدة من تيار المنتج، ولكنه فعال ضد الفيروسات الحمضية.

إنها عبارة عن مزيج من ثلاث إلى أربع عمليات وحدة مستقلة ومتعامدة تعمل معًا على ضمان سلامة منتجات التكنولوجيا الحيوية من الفيروسات.

من المفترض عمومًا أن خطوة المعالجة القوية والفعالة والموثوقة ستكون قادرة على إزالة أو إلغاء تنشيط عدد كبير من الفيروسات (يتم تعريفها عادةً على أنها 4 log10 أو أكبر، حيث يتم حساب قيمة تقليل السجل أو LRV على أنها log10 للإجمالي عدد الفيروسات في الإدخال مقسومًا على إجمالي عدد الفيروسات في الإخراج). ومع ذلك، لا يمكن استخدام LRV كمقياس مطلق واحد لفعالية الخطوة. قد تكون البيانات أولية. وهي سهلة النمذجة، وغير حساسة نسبيًا للتغيرات في ظروف العملية، وفعالة ضد مجموعة من الفيروسات (منظمة الصحة العالمية 2004).

من المعترف به على نطاق واسع أن الترشيح الفيروسي هو خطوة عملية قوية وفعالة وهو عنصر أساسي في الاستراتيجية الشاملة لتقليل مخاطر الجسيمات الفيروسية الخارجية والداخلية أثناء تصنيع منتجات التكنولوجيا الحيوية.

غالبًا ما تعمل المرشحات الفيروسية من خلال آليات الاحتفاظ القوية القائمة على الحجم. واستنادًا إلى آلية العمل القوية هذه، فإن المرشحات الفيروسية أكثر احتمالية من الخطوات الكروماتوغرافية لتوفير احتجاز فيروسي يمكن التنبؤ به لمجموعة من الفيروسات. وذلك لأن المرشح أقل عرضة للتأثر بالاختلافات في الخواص الفيزيائية والكيميائية لمختلف الفيروسات وتفاعلات راتنجات الفيروس التي تنظمها ظروف التشغيل. لذلك، يتم استخدام خطوة الترشيح الفيروسي بشكل شائع في عمليات تنقية البروتين العلاجي المؤتلف المصممة جيدًا (EMEA 1996)، والتي ثبت أيضًا أنها تتمتع بأداء قوي في صناعة معالجة البلازما.

ومع ذلك، فإن منتجات الدم هي بمثابة سيف ذو حدين، فهو لا ينقذ آلاف الأرواح فحسب، بل يحمل أيضًا إمكانية نشر الأمراض وتشكيل خطر على صحة الإنسان. وفقًا للإحصاءات، في الفترة من 1977 إلى 1984، تلقى ما لا يقل عن 30,000 من متلقي الدم في الولايات المتحدة دمًا مصابًا بفيروس الإيدز. في عام 1985، أصيب 1,200 من أصل 3000 من مرضى الهيموفيليا في فرنسا بمرض الإيدز من خلال عمليات نقل الدم أو منتجات الدم.

ووفقا لمنظمة الصحة العالمية، فإن ما بين 5% إلى 10% من حالات الإصابة بالإيدز في جميع أنحاء العالم ناجمة عن عمليات نقل الدم المصاب بالإيدز أو منتجات الدم. وكانت أول حالة إصابة بالإيدز في الصين نتيجة استخدام منتجات دم مستوردة مصابة بفيروس الإيدز. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ أيضًا عن انتقال أمراض التهاب الكبد B وC بسبب نقل الدم ومشتقاته.

1. أهم الفيروسات التي تنتقل عن طريق مشتقات الدم وخصائصها

هناك أنواع عديدة من الفيروسات التي تنتقل عن طريق الدم ومشتقاته، كما هو مبين في الجدول رقم 1. ومن بينها فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) وفيروس التهاب الكبد (B) وفيروس التهاب الكبد الوبائي (HCV)، وقد أثارت اهتمام الدوائر الطبية المحلية والأجنبية بسبب ارتفاع معدل الإصابة بها وأضرارها الجسيمة.

ولأن الدم ومشتقاته لديها القدرة على نشر الفيروسات، فقد أثر ذلك بشكل خطير على تطبيقه في الوقاية من الأمراض وعلاجها. لذلك، في إنتاج منتجات الدم، يجب إضافة عمليات تعطيل الفيروسات وإزالتها لضمان سلامة منتجات الدم.

2. الطرق الرئيسية لتعطيل وإزالة الفيروس

من أجل ضمان سلامة منتجات الدم، بالإضافة إلى اختيار المتبرعين بالدم، والتحصين حيثما أمكن، والاختبار الصارم للدم الذي تم جمعه وغيرها من التدابير، يعد تعطيل وإزالة العلاج الفيروسي لمنتجات الدم رابطًا مهمًا لضمان سلامة منتجات الدم. سلامة نقل الدم. يتم وصف العديد من الطرق الشائعة والفعالة لتعطيل الفيروسات وإزالتها بالتفصيل أدناه.

الأساس النظري لهذه الطريقة هو أن معدل تدمير بنية الفيروس أعلى بكثير من بنية البروتين من خلال اختيار درجة الحرارة ووقت العمل. ما يقرب من 50 عامًا من نتائج الاستخدام السريري والتجارب الحديثة على الحيوانات أكدت أن الزلال في المحلول بعد 60 درجة، 10 ساعات من المعالجة الحرارية، أي تطهير باستور، لا يمكنه تعطيل فيروس التهاب الكبد B فحسب، بل يمكنه أيضًا تعطيل فيروس التهاب الكبد الوبائي سي وفيروس نقص المناعة البشرية، مما يجعل الألبومين الأكثر موثوقية. منتج الدم في السلامة الفيروسية.

في الآونة الأخيرة، تم توسيع عملية باستير لتشمل إنتاج IVIG، FVI، FIX، الفيبرينوجين وغيرها من المنتجات. بريدونكو وآخرون. أضافت عملية تعطيل نشاط الفيروس هذه إلى عملية IVIG لإنتاج الإيثانول منخفض الحرارة، أي أنه تم تنفيذ طريقة باستور في ظل ظروف عدم وجود مثبت، وانخفاض الملح والحموضة، وانخفض عيار الفيروس بمقدار 5 سجل. سيموندز وآخرون. تم اختبار الفيروس المنقول عن طريق نقل الدم (TTV) للمستحضرات المركزة FVⅢ وFIX المستخدمة سريريًا في المملكة المتحدة، ووجد أن معدل اكتشاف TTV للمنتجات دون تعطيل فيروس باستور كان 50% إلى 75%، ومعدل الاكتشاف الإيجابي من المنتجات بعد تعطيل باستور كان 0.

كان معدل TTV الإيجابي 27٪ في 84 مريضًا بالهيموفيليا في المملكة المتحدة استخدموا منتجات عوامل التخثر غير المعطلة، في حين كان 1 فقط من 19 مريضًا يستخدمون منتجات عوامل التخثر المعطلة بالفيروسات إيجابيًا، مع معدل اكتشاف إيجابي قدره 5٪. ولذلك، فإن عملية تعطيل الفيروس فعالة جدًا في تحسين سلامة منتجات الدم.

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. لقد ثبت أن عددًا كبيرًا من منتجات الدم المعطلة بطريقة S/D آمنة وموثوقة من خلال التطبيق السريري طويل الأمد، لذلك يتم استخدامها على نطاق واسع. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لا تتمتع بقدرة على التعطيل ضد الفيروسات الصغيرة B19 وHEV والفيروسات الأخرى غير المغلفة بالدهون.

ويعني تعطيل الحرارة الجافة أن المستحضر المجفف بالتجميد يتم معالجته بالتسخين ويتم قتل الفيروس بالحرارة الجافة. طرق الحرارة الجافة شائعة الاستخدام هي 60 درجة ~80 درجة، 10~72 ساعة طريقة التسخين و80 درجة، 72 ساعة طريقة المعالجة. في وقت مبكر من أوائل الثمانينات، كان من المفيد تسخين المستحضر المركز المجفف بالتجميد ومركب البروثرومبين عند درجة حرارة 60 درجة ~ 80 درجة لمدة 10 ~ 72 ساعة. ومع ذلك، فقد ثبت أن هذه الطريقة لا يمكنها تعطيل فيروس التهاب الكبد B وفيروس التهاب الكبد الوبائي وفيروس نقص المناعة البشرية بشكل كامل. لقد ثبت أن المعالجة الحرارية الجافة عند 80 درجة و72 ساعة فعالة في تعطيل نشاط فيروس التهاب الكبد B وفيروس التهاب الكبد C وفيروس نقص المناعة البشرية. كانت هناك أيضًا تقارير حديثة عن مستحضرات مجففة بالتجميد لعوامل التخثر عند درجة حرارة 100 درجة. قام Xu Jinbo et al بمعالجة IgG عند 100 درجة لمدة 30 دقيقة وفيروس التهاب الفم الحويصلي المعطل 8.2 Log. يقوم بعض الأشخاص بتجميد (FVIII) المجفف عند درجة 68 لمدة 72 ساعة، في الحالة الجافة ثم يتم تسخينه عند 100 درجة لمدة 0.5 إلى 1 ساعة. هذه الطريقة اقتصادية نسبيا.

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 سجل الخلايا المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية، وظلت الصفائح الدموية جيدة بعد 7 أيام من الحفظ الوظيفي في المختبر، وهو ما تمت الموافقة عليه من قبل إدارة الغذاء والدواء للتجارب السريرية.

ومن بين هذه الطرق، تمت الموافقة على طريقة تطهير باستور وطريقة S/D من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) وتستخدم على نطاق واسع في العالم. تعتبر طريقة تعطيل الحرارة الجافة مناسبة بشكل أساسي لتعطيل الفيروسات في المستحضرات المجففة بالتجميد. الطريقة الكيميائية الضوئية لها تأثير تثبيط قوي على الفيروسات المغلفة بالدهون، وقد تم استخدامها في تعطيل فيروس البلازما بالكامل في أوروبا، ولها آفاق واسعة لتعطيل الفيروس في مكونات خلايا الدم. ومع ذلك، فإن كل هذه الطرق لها عيوبها الخاصة، مثل تعقيم باستور ليس مثاليًا لتعطيل بعض الفيروسات المقاومة للحرارة؛ لم تتمكن طريقة S/D من تعطيل الفيروس غير المغلف بالليبو بشكل فعال. ألحقت الطريقة الكيميائية الضوئية ضررًا كبيرًا بنشاط بعض بروتينات البلازما. يُظهر الاستخدام السريري الحالي لتحقيقات المتابعة أنه لا توجد طريقة لتعطيل الفيروس يمكن أن تضمن خلو منتجات الدم تمامًا من خطر انتقال الفيروسات.

في إنتاج منتجات الدم، لا يمكن لعملية تعطيل واحدة أن تعطل جميع الفيروسات؛ وبالإضافة إلى ذلك، فإن الفيروس نفسه عبارة عن بروتين غير متجانس، مثل المدخلات مع المنتج سوف تنتج ردود فعل سلبية؛ وفي الوقت نفسه، ونظرًا لمحدودية المستوى الفني، لا تزال هناك فيروسات لم يتم العثور على خصائصها أو فهمها، وبالتالي فإن طرق تعطيل الفيروسات الحالية لا يمكنها ضمان تأثير تعطيل هذه الفيروسات. ولذلك، فإن التعطيل وحده لا يضمن سلامة المنتج ويجب إزالته من المنتج. لذا تحظى تكنولوجيا إزالة الفيروسات باهتمام متزايد. يتم وصف عمليتين فعالتين وشائعتين لإزالة الفيروسات أدناه بإيجاز.

تشير التكنولوجيا الكروماتوغرافية إلى استخدام المكونات المختلفة وتقارب الطور الثابت أو اختلافات التفاعل لتحقيق فصل المكونات المختلفة. باعتبارها تقنية متقدمة لإنتاج منتجات الدم، فإن اللوني في حد ذاته له تأثير في إزالة الفيروسات، وخاصة كروماتوغرافيا الألفة وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني. بالنسبة لكروماتوغرافيا التبادل الأيوني، يتمتع الشطف بمزايا أكثر من الاختراق في إزالة الفيروسات. يوضح الجدول 2 إحصائيات البيانات الخاصة بمعدل إزالة HAV بواسطة التقنية الكروماتوغرافية في عملية إنتاج الألبومين بواسطة شركة CSL في أستراليا. كما يتبين من الجدول 2، فإن كروماتوغرافيا التبادل الأيوني وترشيح الهلام أكثر فعالية في إزالة HAV، بمعدل إزالة إجمالي قدره 10.9 Log.

في إنتاج العامل الثامن، تقوم شركة باكستر هيلثير بإجراء كروماتوغرافيا الألفة المناعية باستخدام المواد الهلامية المعالجة بالأجسام المضادة للعامل الثامن، والتي يمكنها إزالة (4.2±0.1)سجل و(5.3±0.9)سجل من غير - الفيروسات المغلفة بالدهون مثل PPV وHAV على التوالي.

بالنسبة لبعض الفيروسات ذات القطر السطحي الصغير، مثل فيروس HAV والفيروس الصغير B19، يعد الترشيح بالغشاء النانوي هو طريقة الإزالة الأكثر فعالية. إنه يستفيد من اختلاف الحجم بين البروتينات والفيروسات وامتصاص الفيروسات بواسطة غشاء المرشح لعزل الفيروسات. تم إجراء دراسة مختبرية في موقع Sanquin Blood Supply في هولندا حول إزالة الفيروسات عن طريق إضافة ترشيح غشاء نانوي Planova 15N من خطوة واحدة ومرحلتين إلى عملية إنتاج مركب البروثرومبين. لقد وجد أن معدلات إزالة فيروس نقص المناعة البشرية وفيروس الالتهاب الكبدي الوبائي والفيروسات الأخرى زادت بدرجات متفاوتة بعد الترشيح بالغشاء النانوي (انظر الجدول 3).

ومع ذلك، قد تحدث المشاكل التالية عند تطبيق هذه الطريقة على الإنتاج الصناعي: أولاً، بسبب اللزوجة العالية للمنتج ووجود بروتينات ذات قطر كبير، يجب ألا يكون حجم مسام الغشاء المحدد بواسطة المرشح صغيرًا جدًا، مما يحد من إزالة الفيروسات ذات القطر الصغير مثل فيروس التهاب الكبد الوبائي (سي)؛ ثانيًا، سيؤثر استقرار التحكم في حجم مسام الغشاء في عملية إنتاج المرشح على إزالة الفيروس. ثالثًا، عندما يتم حظر فتحة الغشاء الأصغر من قطر جسيم الفيروس، سيتم تقليل معدل تدفق المنتج، مما يؤثر على العائد. ولذلك، فإن اختيار الأغشية التي تتناسب خصائصها وحجم مسامها مع احتياجات المنتجات المعالجة يعد عاملاً مهمًا في ما إذا كان ترشيح الغشاء النانوي يمكنه إزالة الفيروسات.

وفي إطار ضمان جودة مصدر الدم، تعد عملية إبطال مفعول الفيروس وإزالته وسيلة مهمة وضرورية لضمان سلامة منتجات الدم. إن استخدام عملية فيروسية معطلة واحدة فقط لا يمكن أن يضمن بشكل مطلق سلامة منتجات الدم. على أساس تقنية تعطيل الفيروس، تمت إضافة تقنية إزالة الفيروس مثل اللوني وترشيح النانوفيلم، وتم زيادة معدل إزالة الفيروس بشكل كبير، وتم تحسين تأثير تعطيل الفيروس وإزالته بشكل كبير. في الوقت الحاضر، اقترحت أوروبا بوضوح أنه في عملية إنتاج منتجات الدم، يجب استخدام عملية تعطيل وإزالة الفيروسات مرة واحدة على الأقل لضمان سلامة منتجات الدم.

في الصين، تستخدم معظم الشركات المصنعة لمنتجات الدم عملية فيروس واحدة معطلة فقط في عملية الإنتاج، مثل طريقة تطهير باستور، وطريقة S/D، وما إلى ذلك، ولكنها لا تستخدم عملية إزالة الفيروس، مما يؤثر بشكل خطير على جودة منتجات الدم. مع انضمام الصين إلى منظمة التجارة العالمية، ستكون عملية الإنتاج ومعايير الجودة لمنتجات الدم المحلية متوافقة مع العالم، وإلا فلن تتمكن من ضمان حصة السوق المحلية الحالية، ولكنها لن تتمكن أيضًا من التنافس مع منتجات مماثلة في بلدان أخرى في العالم. السوق الدولية.

ولذلك، يجب على الشركات المصنعة لمنتجات الدم في الصين تحسين عملية الإنتاج، وتعزيز تعطيل الفيروس وإزالته، وذلك لضمان جودة المنتج وسلامته بشكل كامل. ولذلك، سيكون الاتجاه لدى مصنعي منتجات الدم الصينيين هو استخدام اللوني لتنقية منتجات الدم وإزالة الفيروسات لضمان سلامة منتجات الدم.

Guidling Technology هي مؤسسة وطنية ذات تقنية عالية تركز على المستحضرات الصيدلانية الحيوية وزراعة الخلايا وتنقية وتركيز الطب الحيوي والتشخيص والسوائل الصناعية. لقد نجحنا في تطوير أجهزة تصفية الطرد المركزي، وأشرطة الترشيح الفائق والترشيح الدقيق، ومرشح الفيروسات، ونظام TFF، ومرشح العمق، والألياف المجوفة، وما إلى ذلك. والتي تلبي تمامًا سيناريوهات تطبيق المستحضرات الصيدلانية الحيوية، وثقافة الخلايا، وما إلى ذلك. تُستخدم الأغشية والمرشحات الغشائية الخاصة بنا على نطاق واسع في التركيز والاستخلاص والفصل للترشيح المسبق والترشيح الدقيق والترشيح الفائق والترشيح النانوي. تلبي خطوط منتجاتنا العديدة، بدءًا من الترشيح المعملي الصغير ذو الاستخدام الواحد وحتى أنظمة ترشيح الإنتاج واختبار العقم والتخمير وزراعة الخلايا والمزيد، احتياجات الاختبار والإنتاج. تتطلع شركة Guidling Technology إلى التعاون معك!

زوج من: عملية التنقية النهائية للقاح إسهال الخنازير

في المادة التالية : آلية والتحكم في تلوث غشاء الترشيح الفائق