تطبيق الترشيح الفائق في استخلاص الكولاجين الطبيعي

يتمتع الكولاجين، باعتباره مصدرًا طبيعيًا للبروتين، بتوافق حيوي جيد، وقوة استضداد منخفضة، وقابلية للتحلل البيولوجي والإرقاء، وبنيته الحلزونية الضيقة وخصائصه الخاصة، وكلها توفر متطلبات أساسية لتصنيعه. لا يستخدم الكولاجين ومشتقاته كمواد تعبئة وتغليف ومستحضرات تجميل ومنتجات رعاية صحية فحسب، بل يستخدم أيضًا كمضافات غذائية لتحسين منتج اللحوم، ويلعب دورًا مهمًا، خاصة في المجال الطبي.

 

ما هو الكولاجين?

 

الكولاجين هو جزيء بيولوجي كبير، وهو المكون الرئيسي للنسيج الضام الحيواني، وهو البروتين الوظيفي الأكثر وفرة والموزع على نطاق واسع في الثدييات، وهو ما يمثل 25٪ إلى 30٪ من إجمالي البروتين، وحتى ما يصل إلى 80٪ أو أكثر في بعض الكائنات الحية. يلعب دور الأنسجة الرابطة في الخلايا الحيوانية.

يتم قياس أن جسم الشخص البالغ لديه حوالي 3 كجم من الكولاجين، والذي يوجد بشكل رئيسي في جلد الإنسان والعظام والعينين والأسنان والأوتار والأعضاء الداخلية (بما في ذلك القلب والمعدة والأمعاء والأوعية الدموية) وأجزاء أخرى من جسم الإنسان. وتتمثل وظيفتها في الحفاظ على شكل وبنية الجلد والأنسجة والأعضاء، كما أنه مادة خام مهمة لإصلاح الأنسجة المختلفة بعد الإصابة.

 

هناك أنواع عديدة من بروتين الكولاجين، والأنواع الشائعة هي النوع الأول والنوع الثاني والنوع الثالث والنوع الخامس والحادي عشر. نظرًا لتوافقه الحيوي الجيد وقابليته للتحلل الحيوي والنشاط الحيوي، فقد تم استخدام الكولاجين على نطاق واسع في الغذاء والدواء وهندسة الأنسجة ومستحضرات التجميل وغيرها من المجالات.

كيفية استخراج الكولاجين الطبيعي

الأنسجة الحيوانية من الماشية والدواجن هي الطريقة الرئيسية للناس للحصول على الكولاجين الطبيعي وببتيدات الكولاجين. ومع ذلك، بسبب الأمراض الحيوانية ذات الصلة وبعض المعتقدات الدينية، فإن استخدام الناس للكولاجين ومنتجاته من الثدييات البرية محدود، ويتحول التطور تدريجياً إلى الكائنات البحرية. أكدت هيئة سلامة الأغذية الأوروبية (EFSA) أنه حتى الكولاجين المشتق من عظام الحيوانات ليس لديه القدرة على إصابة مرض جنون البقر والأمراض الأخرى ذات الصلة. بسبب الاختلافات في تركيب الأحماض الأمينية ودرجة التشابك، فإن الحيوانات المائية، وخاصة الكولاجين الغني بمخلفاتها المعالجة مثل الجلد والعظام والقشور، تتمتع بالعديد من المزايا التي لا يتمتع بها الكولاجين الحيواني. بالإضافة إلى ذلك، من الواضح أن الكولاجين المشتق من الحيوانات البحرية يتفوق على الكولاجين المستخرج من الحيوانات البرية في بعض الجوانب، مثل انخفاض القدرة المضادة للحساسية ونقص الحساسية. لذلك، قد يحل الكولاجين المائي تدريجياً محل الكولاجين الحيواني الأرضي. تم أخذ عملية استخلاص الكولاجين من قشور أسماك الكارب العشبي كمثال.

 

استخلاص الكولاجين من قشور أسماك الكارب العشبي بطريقة الترشيح الفائق

1. المواد والأساليب

1.1 عينة الاختبار

مستخلص مائي من الكولاجين الخام.

1.2 طرق الاختبار

1.2.1 مسار عملية الترشيح الفائق

 

1.2.2 تحديد عملية الترشيح المسبق

في هذا الاختبار، تتم مقارنة وتحليل طريقة الترشيح الفراغي وطريقة الترشيح الدقيق لتحديد أفضل عملية ترشيح مسبق. طرق الاختبار المحددة هي كما يلي:

① تم ترشيح مستخلص ماء الكولاجين الخام عن طريق الضخ الفراغي لورق الترشيح لإزالة الجزيئات العالقة والشوائب في مستخلص الماء.

② تم ترشيح مستخلص ماء الكولاجين الخام بواسطة غشاء ترشيح دقيق 0.2 ميكرومتر لإزالة المواد غير القابلة للذوبان والشوائب في مستخلص الماء.

 

1.2.3 اختيار حجم مسام غشاء الترشيح الفائق

كان حجم المسام لغشاء الترشيح الفائق 100 كيلو دالتون.

 

1.2.4 تجربة عامل واحد لعملية تنقية الترشيح الفائق

تم استخدام تقنية الترشيح الفائق لتنقية مستخلص ماء الكولاجين الخام، وتمت دراسة تجارب العامل الفردي حول تأثيرات ضغط التشغيل ودرجة حرارة التشغيل وقيمة الرقم الهيدروجيني على احتباس الكولاجين. بعد تشغيل معدات الترشيح الفائق لفترة من الوقت واستقرارها، تمت دراسة تأثير العوامل المختلفة على احتباس الكولاجين.

 

1.2.5 صيغة الحساب

 

2. النتائج والتحليل

2.1 تحليل نتائج عملية الترشيح المسبق

يتم عرض نتائج المقارنة بين طريقتي الترشيح للاستخراج الفراغي والترشيح الدقيق في الجدول التالي.

 

يمكن أن نرى من الجدول أن كلاً من طريقة الترشيح الفراغي وطريقة الترشيح الدقيق يمكنهما إزالة الشوائب والمواد الصلبة غير القابلة للذوبان في المحلول، لكن طريقة الترشيح الدقيق لها تأثير وقائي أفضل على البروتينات، أي أن الخسارة ليست واضحة، وطريقة الترشيح الفراغي هي من السهل أن تسبب فقدان البروتينات. بالإضافة إلى ذلك، تظهر طريقة الترشيح الفراغي تعكرًا بعد وضع المرشح لفترة من الوقت، ولا يزال المرشح الدقيق واضحًا وشفافًا، لذلك يتم اختيار الترشيح الدقيق كعملية معالجة مسبقة للترشيح الفائق.

 

2.2 اختبار العامل الواحد لعملية الترشيح الفائق

2.2.1 تأثير ضغط الترشيح الفائق على معدل الاستبقاء

تحت ظروف درجة الحرارة 40 درجة ودرجة الحموضة =9.0، تأثير ضغوط الترشيح الفائق المختلفة (0.07MPa، {{9} }.09MPa، 0.11MPa، 0.13MPa و 0.15MPa) تمت دراستها على احتباس البروتين. وتظهر النتائج في الشكل أدناه.

كما يتبين من الشكل أعلاه، مع زيادة ضغط التشغيل، ينخفض ​​معدل الاحتفاظ بالبروتين تدريجيًا. عندما يكون ضغط التشغيل {{0}}.07MPa، يكون معدل الاحتفاظ بالبروتين 96.53%، وعندما يكون ضغط التشغيل 0.15MPa، يكون معدل الاحتفاظ بالبروتين 84.38%. وذلك لأن تأثير الفصل للترشيح الفائق على المواد يتم من خلال فرق الضغط. في نطاق ضغط التشغيل المنخفض، يمكن للجزيئات الصغيرة أن تمر بسرعة عبر الغشاء، بينما يمكن احتجاز الجزيئات الكبيرة بواسطة غشاء الترشيح الفائق وتتراكم على سطح الغشاء. في هذا الوقت، يشكل سطح الغشاء ومستخلص الماء فرق تركيز، مما يؤدي إلى مقاومة استقطاب التركيز. في هذا الوقت، يكون الضغط منخفضًا نسبيًا، ولا يمكن أن يكون له تأثير كبير على معدل الاحتفاظ. ومع ذلك، مع زيادة الضغط، تزداد مقاومة استقطاب التركيز تدريجياً، ويصل فرق التركيز بين سطح الغشاء ومستخلص الماء إلى التوازن. عندما يتجاوز الضغط هذا التوازن، يمكن أن تتشكل طبقة هلامية على سطح الغشاء (وهو ما يتوافق مع النظرية القائلة بأن استقطاب التركيز وطبقة التكثيف تتشكل أثناء الترشيح الفائق)، ويستمر الضغط في الزيادة، ويزداد سمك طبقة الهلام ويزداد أيضًا البروتين المتبقي على سطح الغشاء. وهذا يؤدي إلى انخفاض معدل الاحتفاظ. من أجل ضمان تأثير فصل الغشاء، فإن المعلمة المثالية لضغط التشغيل هي 0.07MPa.

 

2.2.2 تأثير درجة الحرارة على احتباس البروتين

تحت ظروف {{0}}.11MPa الضغط ودرجة الحموضة =9.0، تأثيرات درجات الحرارة المختلفة، وهي 25 درجة، 30 درجة، 35 درجة، 40 درجة و 45 درجة، على البروتين تمت دراسة الاحتفاظ. وتظهر النتائج في الشكل أدناه.

كما يتبين من الشكل أعلاه، فإن معدل الاحتفاظ بغشاء الترشيح الفائق يزداد تدريجياً مع زيادة درجة الحرارة، ويصل إلى الحد الأقصى عند 45 درجة، بمعدل استبقاء 97.01%. وذلك لأن لزوجة الكولاجين ترتبط ارتباطًا وثيقًا بدرجة الحرارة. عندما تكون درجة الحرارة منخفضة، تكون لزوجة الكولاجين أكبر، ومن السهل أن يشكل تراكم الكولاجين على سطح الغشاء مقاومة، مما يؤدي إلى انخفاض معدل الاحتفاظ به. عندما ترتفع درجة الحرارة، تنخفض لزوجة الكولاجين، ويضعف التفاعل بين جزيئات الكولاجين، ويزيد معدل نقل الكتلة، وتضعف ظاهرة استقطاب التركيز، ويزداد معدل الاحتفاظ. سبب آخر لزيادة معدل الاحتفاظ هو أن درجة الحرارة ترتفع، كما تزداد قابلية ذوبان الكولاجين بشكل مماثل، وتقل ظاهرة انسداد الكولاجين للغشاء، وبالتالي فإن درجة الحرارة المثالية للترشيح الفائق هي 45 درجة.

 

2.2.3 تأثير قيمة الرقم الهيدروجيني على احتباس البروتين

تحت ظروف الضغط {{0}}.11MPa ودرجة الحرارة 40 درجة، تأثير ظروف الرقم الهيدروجيني المختلفة، وهي الرقم الهيدروجيني =6.0، الرقم الهيدروجيني {{ 5}}.{{10}}، تمت دراسة الرقم الهيدروجيني =8.0، الرقم الهيدروجيني =9.0 والرقم الهيدروجيني =10.0، على معدل الاستبقاء. وتظهر النتائج في الشكل أدناه.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7، ويزداد معدل الاحتفاظ تدريجيا مع زيادة قيمة الرقم الهيدروجيني. وذلك لأن غشاء الترشيح الفائق عبارة عن غشاء قيقب بولي إيثر بشحنة سالبة، والكولاجين مشحون بشحنة سالبة في الظروف القلوية. تشكل جزيئات الكولاجين سالبة الشحنة حالة متبادلة مع غشاء الترشيح الفائق بنفس الشحنة، وبالتالي ليس من السهل أن تبقى جزيئات الكولاجين على سطح الغشاء وتسد الغشاء. ولذلك، فإن قيمة الرقم الهيدروجيني الأمثل للترشيح الفائق هي 8-10.

 

2.3 تحسين عملية الترشيح الفائق والتحقق من النتائج

وفقًا لتحليل برنامج Design-Expert8.05، فإن معلمات العملية المثالية هي: ضغط التشغيل 0.14MPa، درجة حرارة التشغيل 40.98 درجة، المحلول pH{{7 }}.43، ومعدل الاحتفاظ 92.551%. بالنظر إلى قابلية تشغيل المعلمات الفعلية، تم اختيار ظروف الترشيح الفائق كضغط تشغيل 0.14 ميجا باسكال، ودرجة حرارة تشغيل 40 درجة وقيمة 9.50 درجة حموضة لمحلول المادة، وبدأ التحقق من الاختبار بعد بدء تشغيل نظام الترشيح الفائق واستقراره. وكانت نتيجة معدل الاستبقاء (92.61±0.1) % (n=3). إن القيم المتوقعة للمعادلة تشبه بشكل أساسي القيم المقاسة، مما يدل على أن نتائج معلمة الحالة المتوقعة تتفق مع نتائج الحالة الفعلية.

 

2.4 نتائج التحليل الكهربي

تم تحليل الكولاجين المنقى بواسطة الترحيل الكهربائي SDS-PAGE، وتظهر النتائج في الشكل التالي.

 

كما يتبين من الشكل أعلاه، الخط 1 هو الكولاجين المنقى لهذا الاختبار، والخط 2 هو عينة الكولاجين القياسية لوتر الساق. يمكن أن نرى من خلال الترحيل الكهربائي SDS-PAGE أنه يمكن تحديد الكولاجين في هذه الدراسة على أنه كولاجين، ولكن يبدو أن الحدود بين سلسلة الببتيد a1 وسلسلة الببتيد a2 غير واضحة. يتبين من الخريطة الكهربي عدم وجود شوائب بروتينية أخرى، لذلك يمكن استنتاج أن الكولاجين المنقى عالي النقاوة.

حول جيدلينج

 

Guidling Technology هي مؤسسة وطنية ذات تقنية عالية تركز على المستحضرات الصيدلانية الحيوية وزراعة الخلايا وتنقية وتركيز الطب الحيوي والتشخيص والسوائل الصناعية. لقد نجحنا في تطوير أجهزة تصفية الطرد المركزي، وأشرطة الترشيح الفائق والترشيح الدقيق، ومرشح الفيروسات، ونظام TFF، ومرشح العمق، والألياف المجوفة، وما إلى ذلك. والتي تلبي تمامًا سيناريوهات تطبيق المستحضرات الصيدلانية الحيوية، وثقافة الخلايا، وما إلى ذلك. تُستخدم الأغشية والمرشحات الغشائية الخاصة بنا على نطاق واسع في التركيز والاستخلاص والفصل للترشيح المسبق والترشيح الدقيق والترشيح الفائق والترشيح النانوي. تلبي خطوط منتجاتنا العديدة، بدءًا من الترشيح المعملي الصغير ذو الاستخدام الواحد وحتى أنظمة ترشيح الإنتاج واختبار العقم والتخمير وزراعة الخلايا، احتياجات الاختبار والإنتاج. تتطلع شركة Guidling Technology إلى التعاون معك!